抗坏血酸作为还原剂制备免疫检测用胶体金的工艺研究

冯　海，张　莹，俞　洁，荣　慧，朱俐俐

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

抗坏血酸作为还原剂制备免疫检测用胶体金的工艺研究

冯海，张莹，俞洁，荣慧，朱俐俐

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

摘要：探究了以抗坏血酸(AA)还原氯金酸(HAuCl4)来制备免疫检测用胶体金的工艺条件.以粒径及其分布为主要指标，对制备过程中反应时间、反应温度、溶液pH和n(AA)∶n(HAuCl4)四个影响因素进行了研究，通过Box-Behnken响应面试验优化得到最优制备工艺：n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，反应时间为2 h，温度为20 ℃，溶液pH=11.该条件下制得胶体金的粒径为(45.73±2.41) nm，PDI=0.207±0.013.该制备条件温和，所得胶体金的粒径分布较窄，可以用于免疫检测.

关键词：胶体金；抗坏血酸；响应面优化

中图分类号：O611.4

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2015)01-0083-04

The study of preparation technique of colloidal gold used in immunoassay

using ascorbic acid as a reducing agent

FENG Hai, ZHANG Ying, YU Jie, RONG Hui, ZHU Lili

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:The synthesis of colloidal gold used in immunoassay via the reduction of HAuCl4by ascorbic acid (AA) has been studied, with focus on the optimization of preparation technique. The effects of reaction time, temperature, pH and n(AA)∶n(HAuCl4) that influence the size and its distribution of colloidal gold have been studied by optimizing the preparation parameters through Box-Behnken Design RSM. The optimal conditions were found as follows: n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1, pH=11, and reacting under 20 ℃ for 2 hours. The size of gold nanoparticle we prepared was (45.73±2.41) nm, and PDI was 0.207±0.013. The colloidal gold nanoparticles are synthesized under mild condition and have a narrow size distribution, and can therefore be used for immunoassay.

Keywords:colloidal gold; ascorbic acid; RSM

金纳米粒子(Gold nanoparticles, GNPs)，也叫胶体金，因其特殊的稳定性、小尺寸效应、表面效应及生物亲和性等使之成为光学[1]、电子[2]、催化[3]、生物医药[4]和免疫检测[5]等方面研究和应用的热点.胶体金的这些应用大多依赖于它们的粒径、粒径分布和形状.如用于免疫层析检测的胶体金为球形颗粒，粒径通常在40 nm左右，粒径分布窄[6].

迄今为止，已有多种金纳米粒制备方法，包括化学还原法、相转移法和反胶束法等.其中，化学还原法是可控制备各种尺寸和形状的胶体金的方法，常用的还原剂有硼氢化钠、柠檬酸钠和鞣酸-柠檬酸钠等.抗坏血酸与其他还原剂相比具有生物相容性好、毒性低等特点，但其制备免疫层析检测用胶体金的报道较少.以AA作为还原剂制备胶体金，探究反应条件对胶体金粒径及其分布的影响.

1材料与方法

1.1试剂与仪器

氯金酸(上海三爱思试剂有限公司，AR)；抗坏血酸(广东光华化学有限公司，AR)；恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；Zetasizer Nano ZS90纳米激光粒度仪(英国马尔文公司)；SpectraMax M2酶标仪(美国分子仪器公司)；Tecnai G2透射电子显微镜(FEI公司).

1.2方法

1.2.1单因素考察

以抗坏血酸作为还原剂制备胶体金[7]，对反应时间(0~180 min)、温度(10~100 ℃)、溶液pH(3，6，7，8，11，12)及抗坏血酸与氯金酸摩尔比(n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)单因素进行考察，每个水平重复实验3次.

1.2.2制备工艺优化

根据单因素试验结果，选择温度、n(AA)∶n(HAuCl4)和溶液pH为试验因素，以粒径为指标利用响应面法优化制备工艺.根据Box-Behnken中心组合设计原理，按表1设计试验，每个试验重复3次，取其平均值.

表1　响应面试验的变量和水平

1.2.3分析方法

用酶标仪记录胶体金的可见光吸收光谱，用激光粒度仪测定胶体金的粒径和粒径分布，并用透射电子显微镜(TEM)表征胶体金的形貌和粒径.

2结果与讨论

2.1单因素考察

2.1.1反应时间

由于胶体金的最大吸收波长(λmax)与粒径相关，λmax越大平均粒径越大，吸收峰宽越窄粒径分布越窄.因此在反应过程中，隔一定时间取1 mL反应液测定可见光吸收光谱，光谱的峰形基本不变，可认为已形成稳定的胶体金.

1-0.5 min;2-1 min;3-2 min;4-4 min;5-6 min;6-8 min;7-10 min;8-30 min;9-60 min;10-120 min;11-180 min;12-0 min图1　胶体金制备过程中可见光吸收光谱随的变化Fig.1　Temporal evolution of UV-vis spectra of colloidal gold

从图1可以看出：加入还原剂前，在可见光波长范围内溶液无吸收峰.加入还原剂后立即出现一个明显的吸收峰，λmax在550~600 nm之间，峰宽较宽.随着反应的进行，吸收峰蓝移，λmax落在500~550 nm范围内，同时峰宽不断减小.120 min后λmax、峰宽基本不变，因此选择反应时间为120 min.

2.1.2反应温度

温度对金颗粒的成核、生长，以及最终颗粒的稳定都有影响.固定n(AA)∶n(HAuCl4)=2∶1，pH=7，反应时间为2 h，以水浴控制温度，研究10~100 ℃范围内温度对抗坏血酸法制备胶体金的粒径及其分布的影响.如图2所示，反应温度为10 ℃时，粒径最小，但PDI(即多分散性指数)较大.随着温度的增加，胶体金的粒径增大，30 ℃之后，温度升高粒径变化不大，而PDI增加.因此反应温度低于30 ℃较好.

2.1.3抗坏血酸与氯金酸的摩尔比

固定温度为20 ℃，pH=7，反应时间为2 h，探究n(AA)∶n(HAuCl4)对胶体金粒径的影响.如图3所示，n(AA)∶n(HAuCl4)对粒径的影响显著，n(AA)∶n(HAuCl4)增大，粒径显著增大(p<0.05)，但PDI无显著差异.

2.1.4溶液pH

固定n(AA)∶n(HAuCl4)=2:1，反应温度为20 ℃，反应时间为2 h，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH调节反应溶液的pH，探究其对胶体金粒径的影响.如图4所示，pH的影响比较复杂.当pH=3时，粒径较小，但PDI较大.pH增加，粒径增大，但当pH=11时，粒径有所减小.

图2　反应温度对胶体金粒径及粒径分布的影响Fig.2　Size and size distribution of colloidal gold prepared with different temperature

图3　n(AA)∶n(HAuCl4)对胶体金粒径及粒径分布的影响Fig.3　Size and size distribution of colloidal gold prepared with different n(AA)∶n(HAuCl4) ratios

图4　pH对胶体金的粒径及其分布的影响Fig.4　The variation in the size and size distribution of colloidal gold as a function of the pH

2.2制备工艺优化

2.2.1响应面优化试验

利用Design-Export 8.0.6软件进行响应面优化试验分析，以粒径R为主要响应指标，结合PDI的大小综合评价胶体金的质量，实验设计和结果如表2所示.

表2响应面实验安排及响应值结果

Table 2The experiment design and result of response surface method

实验号ABC/℃R/nmPDI1231035.070.3342133041.790.3663273083.370.1564273088.030.1855371072.400.2056375091.380.21671113055.260.1908333059.000.3189235058.280.242102115081.400.202112111049.730.164123113072.910.23113273089.310.16814175066.690.24115171049.280.22316273086.410.17417273087.100.191

结果经二次多项式拟合，并对各项进行方差分析，结果见表3.最终拟合方程为

R=-76.417 98+41.125 50A+20.185 03B+1.698 11C+0.027 500AB+0.019 625AC+0.026 438BC-7.893 25AA-1.356 92BB-0.022 533CC

方程拟合显著(p<0.000 1)，失拟值和纯误差较小，R2=0.981 9，标准偏差为3.72，变异系数小(5.42%)，说明该模型可靠，可用于抗坏血酸法制备条件的优化.

图5为以粒径为响应值时各因素的响应面图，n(AA)∶n(HAuCl4)和pH及n(AA)∶n(HAuCl4)和温度交互作用显著，pH和温度交互作用不明显.

2.2.2最优工艺的确定

通常用于免疫层析检测的胶体金直径在40 nm左右，因此选择粒径30~50 nm且PDI<0.25为条件，同时考虑实验的可操作性，最终优化结果是：n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，pH=11，反应温度为20 ℃.在该条件下进行3次实验，所得胶体金粒径为(45.73±2.41) nm，PDI=0.207±0.013，与预测值(47.81 nm)相差不大.样品的TEM照片如图6所示，胶体金颗粒多为球形，平均粒径为39.82 nm，RSD为8.8%.

表3　响应值R的二次多项式模型的方差分析1)

注：1)**为p<0.01,***为p<0.001.

图5　n(AA)∶n(HAuCl4)，pH和温度对胶体金粒径影响的响应面图Fig.5　Response surface plots for the effect of n(AA)∶n(HAuCl4), pH and temperature on the size of colloidal gold

图6　胶体金的TEM照片及其粒径分布Fig.6　TEM images and size distribution diagrams of colloidal gold

3结论

以抗坏血酸作为还原剂，反应时间、反应温度、溶液pH、n(AA)∶n(HAuCl4)等都会影响胶体金的质量.在单因素试验基础上，选择n(AA)∶n(HAuCl4)、温度、pH进行响应面试验优化，得到最优制备工艺：n(AA)∶n(HAuCl4)=1∶1，反应时间为2 h，温度为20 ℃，pH=11.最优条件下制得的胶体金粒径为(45.73±2.41)nm，PDI=0.207±0.013，TEM观察到金颗粒粒径均一，颗粒形状多为球形.该方法简便、条件温和，制得的胶体金粒径分布较窄，可用于免疫层析检测.

参考文献：

[1]JING Li, YU Zhangbin, DU Weidong, et al. Development of a fluorescent and colorimetric detection methods-based protein microarray for serodiagnosis of TORCH infections[J]. Biosensors and Bioelectronics,2008,24(3):376-382.

[2]倪哲明,张峰,胡军,等.具有核壳结构的金属软磁纳米复合材料的研究进展[J].浙江工业大学学报,2009,37(3):246-250.

[3]WITTSTOCK A, ZIELASEK V, BIENER J, et al. Nanoporous gold catalysts for selective gas-phase oxidative coupling of methanol at low temperature[J]. Science,2010,327(5963):319-322.

[4]袁巨龙,刘盛辉.纳米技术的应用及发展动向[J].浙江工业大学学报,2000,28(3):243-249.

[5]张绍庚,段跃强,张德玺，等.胶体金免疫层析试纸条快速检测乙型流感病毒[J].免疫学杂志,2012,28(11):981-984.

[6]CHANDLER J, GURMIN T, ROBINSON N. The place of gold in rapid tests[J]. IVD Technology,2000,6(2):37-49.

[7]TYAGI H, KUSHWAHA A, KUMAR A, et al. pH-dependent synthesis of stabilized gold nanoparticles using ascorbic acid[J]. International Journal of Nanoscience,2011,10(4/5):857-860.

(责任编辑：刘岩)

作者简介：冯海(1973—)，男，浙江杭州人，副教授，研究方向为药物新剂型与新技术，E-mail:fenghai289289@163.com.

收稿日期：2014-10-20