三种中药复方制剂对雏鸡免疫器官发育及免疫功能的影响

杨润霞，吴润，刘磊，寇晓晶，魏姣 ，王玉龙

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　730070；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州　730046)

三种中药复方制剂对雏鸡免疫器官发育及免疫功能的影响

杨润霞1，吴润1，刘磊1，寇晓晶2，魏姣1，王玉龙1

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州730046)

摘要：为了探究中药复方对雏鸡免疫功能及免疫器官发育的影响.试验以黄芪、白术、防风、黄芩和五倍子等单味中药组成3种中药复方制剂，将120只1日龄健康雏鸡分为4组(Ⅰ组，“扶正止泄散”，未加玉屏风散基础复方组；Ⅱ组，“扶正止泄散”复方组；Ⅲ组，“芪术扶正汤”复方组；Ⅳ组，对照，不加喂药)，分别于42、52和62日龄对试验组和对照组鸡进行检测，测定T淋巴细胞、鸡γ-干扰素、抗体效价和免疫器官指数等免疫指标，同时制作组织切片、HE染色，观察其对雏鸡内脏器官发育的影响.结果表明：试验组T淋巴细胞ANAE阳性率、抗体效价和γ-IFN水平显著升高(P<0.01)，Ⅰ、Ⅱ组优于Ⅲ组；免疫器官指数和血细胞数量显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)，Ⅱ组优于Ⅰ组；镜下观察组织切片，各器官结构良好无明显病变.3种中药复方对雏鸡免疫功能具有正向促进作用，增强机体细胞及体液免疫功能，其中Ⅱ组具有明显优势.

关键词：雏鸡；中药复方制剂；免疫功能；器官发育；组织切片

第一作者：杨润霞(1988-)，女，硕士研究生，研究方向为兽医微生物学及免疫学.E-mail：834035123@qq.com

中草药不仅能提高畜禽生长性能，增强或调节鸡体细胞免疫和体液免疫功能[1]，对疾病防治也有一定效果[2,3]，而且因其药性温和、耐药性低、毒副作用小，且具有双向调节等优势已成为动医免疫增强剂发展的方向[4].据此，本研究利用我国丰富的天然中草药，依据中兽医学理论，将所选中草药组方配伍，通过对42、52、62日龄肉仔鸡饲喂试验，比较3种中草药复方对肉仔鸡免疫功能的影响，明确3种中草药复方对肉仔鸡免疫器官发育的影响，为中草药复方制剂的开发应用提供科学依据.

1材料与方法

1.1　试验药品及试剂

淋巴细胞分层液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司生产)，鸡新城疫活疫苗(广西丽原生物股份有限公司生产，批号为131104)，鸡新城疫Ⅳ系苗(Lasota，500羽/瓶)，小牛血清(浙江三利生物制品厂，批号20120301)，鸡γ干扰素(IFN-γ)、酶联免疫试剂盒(上海裕平生物科技有限公司生产),2% α-醋酸萘酯液、1%孔雀绿染色液、瑞氏姬姆萨染色液、2%SPA菌体试剂、4%甲醛溶液等.

中药复方制剂的制备参照文献[5].

1.2　动物分组与试验

将120只1日龄雏鸡随机分为4组，每组30只进行常规饲喂，各组分别于12和32日龄免疫Ⅴ系Lasota新城疫疫苗，18日龄免疫传染性法氏囊疫苗.Ⅰ组为“扶正止泻散”基础复方组，即未加“玉屏风散”；Ⅱ组为“扶正止泻散”复方组；Ⅲ组为“芪术扶正汤”复方组；IV组为不喂药的对照组.各组均在相同环境下饲养62 d.3个试验组喂药方法：试验组分别在31、43、55日龄经饮水饲喂药，每次连续饲喂5 d停药7 d.各组分别于42、52、62日龄进行3次检测.同时采取心脏、脾脏、法氏囊等器官置4%甲醛溶液中固定，用于制作切片.

1.3　检测指标及方法

1.3.1细胞免疫检测指标 T淋巴细胞计数：应用α-醋酸萘酯酶染色(ANAE)方法，无菌采抗凝血5 mL于离心管中，提取淋巴细胞层，加入适量Hank’s液配制成含有细胞数为2~5×106/mL的淋巴细胞悬液.将稀释好的淋巴细胞液涂片，置于2.5%戊二醛中固定，冲洗10 min后再置于孵育液中，37 ℃染色3 h，冲洗后用1%孔雀绿复染30 s，冲洗，干燥.油镜下镜检，计数200个淋巴细胞，胞浆内有红色或紫色颗粒团块者，为α-醋酸奈脂阳性细胞，即T淋巴细胞.

中性粒细胞吞噬试验：将2%SPA 0.1 mL菌体试剂加入到试管内的2 mL的抗凝血中，混匀，置于37 ℃培养箱内30 min，每隔10 min摇动1次试管，摇动2次，最后1次不摇.吸取白细胞层，滴于载玻片上，推片，干燥后瑞氏染色，置于油镜下镜检，视野中随机选取200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数和被吞噬细菌数，按下列公式计算出吞噬率和吞噬指数：

鸡γ-干扰素的测定：用ELISA方法对雏鸡γ-干扰素测定.

血常规检查：白细胞、红细胞计数和淋巴细胞比例均按安丽英[6]所述家禽血液直接染色计数法计数.

1.3.2体液免疫检测指标B淋巴细胞计数：取抗凝血1 mL，加入淋巴细胞分层液，提取淋巴细胞层，加入Hank’s液混匀后配制成含有细胞数为(2~5)×106/mL的淋巴细胞悬液.取上述悬液0.5 mL，加入0.5 mL 0.1%SPA菌体试剂，混匀后放置于4 ℃冰箱内30 min，5%小牛血清-Hank’s液(37 ℃预热)洗涤2次，弃上清，取剩余混悬液1滴推片，瑞氏-姬姆萨染液染色镜检.凡是淋巴细胞表面粘附有5个以上菌体的细胞即为B淋巴细胞.每份标本必须计算不少于200个淋巴细胞，并计算出B淋巴细胞占总淋巴细胞的百分率.

抗体效价测定：采2只健康成年公鸡新鲜血液，立即放入生理盐水中洗涤3次，离心后，按1∶1吸取两只公鸡红细胞，配成1%红细胞悬液，现配现用，新城疫血凝(HA)及血凝抑制试验(HI)参照文献[6].

免疫器官指数的测定： 于42、55和62日龄时各组中随机抽取10只鸡，屠宰并摘取胸腺、脾脏、法氏囊，称质量，计算器官指数.公式如下：

器官指数=器官质量(g)/体质量(kg)

1.3.3组织切片制备方法取出4%甲醛溶液中固定好的组织块，按组织切片制作方法依次进行脱水、透明、包埋制作石蜡切片，HE染色后显微镜下观察.

2结果与分析

2.1　三种中药复方对T淋巴细胞数量及γ-干扰素水平的影响

由表1可知，各龄Ⅰ、Ⅱ组T淋巴细胞数量、γ-干扰素水平与对照组比较均差异极显著(P<0.01)，Ⅲ组42、52日龄淋巴细胞数量与对照组比较差异显著(P<0.05)，γ-干扰素水平与对照组比较差异极显著(P<0.01)；62日龄时T淋巴细胞数量与对照组比较差异不显著(P>0.05)，γ-干扰素水平与对照组比较差异显著(P<0.05).

2.2　三种中药复方对雏鸡中性粒细胞吞噬率及吞噬指数的影响

由表2可知，42日龄时，Ⅰ、Ⅱ组吞噬率与对照组(Ⅳ组)比较，差异极显著(P<0.01)，Ⅲ组与Ⅳ组比较，差异不显著(P>0.05)，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组吞噬指数与Ⅳ组比较，差异极显著(P<0.01)；52日龄时，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组吞噬率及吞噬指数与对照组组比较，均差异极显著(P<0.01)；62日龄时，Ⅰ、Ⅱ组与Ⅳ组比较，吞噬率及吞噬指数均差异极显著(P<0.01)，而Ⅲ组吞噬率与对照组比较，差异不显著(P>0.05)，Ⅲ组吞噬指数与对照组差异显著(P<0.05).

表1　三种中药复方对雏鸡T淋巴细胞ANAE阳性率及γ-干扰素水平的影响结果

表2　三种中药复方对雏鸡中性粒细胞吞噬率及吞噬指数的影响

2.3　三种中药复方对鸡血细胞数量的影响

由表3可知，42日龄时，Ⅰ和Ⅱ组RBC、WBC及淋巴细胞数与对照组比较差异极显著(P<0.01)，Ⅲ组RBC、WBC与对照组比较差异不显著(P>0.05)，而淋巴细胞数量与对照组比较差异极显著；52日龄时，Ⅰ、Ⅱ组RBC、WBC及淋巴细胞数与Ⅳ组比较，差异极显著(P<0.01)，Ⅲ组RBC数量与对照组比较差异显著(P<0.05)，而WBC及淋巴细胞数量与对照组比较差异极显著(P<0.01)；62日龄时，Ⅰ组、Ⅲ组WBC及淋巴细胞数量与对照组比较差异显著，而RBC数与对照组差异不显著(P>0.05).

表3　三种中药复方对雏鸡不同日龄血细胞数量的影响

2.4　三种中药复方对雏鸡SmIg阳性B淋巴细胞数及抗体效价的影响

由表4可知：42日龄时，Ⅰ、Ⅱ组B淋巴细胞阳性率与对照组比较差异极显著(P<0.01)，而Ⅲ组与对照组组比较差异显著(P<0.05)；Ⅱ组抗体效价与对照组组比较差异极显著(P<0.01)，而Ⅰ、Ⅲ组与对照组比较差异不显著(P>0.05).52日龄时，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组B淋巴细胞阳性率与对照组比较差异极显著(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ组抗体效价与对照组比较差异极显著(P<0.01)，而Ⅲ组与对照组比较差异不显著(P>0.05).62日龄时，Ⅰ、Ⅱ组B淋巴细胞阳性与对照组组比较差异极显著(P<0.01)，Ⅲ组与对照组比较差异显著(P<0.05)；Ⅱ组抗体效价与对照组比较差异极显著(P<0.01)，而Ⅰ、Ⅲ组与对照组比较，差异不显著(P>0.05).表明Ⅱ组能显著增加B淋巴细胞阳性率及抗体效价，说明此组方能提高鸡体液免疫功能.

表4　三种中药复方对雏鸡SmIg阳性B淋巴细胞数及抗体效价的影响

2.5　三种中药复方对免疫器官指数的影响

由表5可知：42日龄时，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组胸腺、法氏囊、脾脏指数与对照组比较，差异极显著(P<0.01)；52日龄时，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组胸腺、法氏囊指数与对照组比较，差异极显著(P<0.01)，Ⅰ组、Ⅱ组脾脏指数与对照组比较差异极显著(P<0.01)，而Ⅲ组脾脏指数与对照组比较差异显著(P<0.05)；62日龄时，Ⅰ、Ⅱ组和Ⅲ组法氏囊、脾脏指数与对照组比较差异极显著(P<0.01)，Ⅱ组、Ⅲ组胸腺指数与对照组比较差异极显著(P<0.01)，而Ⅰ组胸腺指数与对照组比较差异显著(P<0.05).

2.6　三种中药复方对雏鸡组织学的影响

肝脏：肝索结构清晰，肝细胞及胞核完整，肝板及肝血窦无明显炎性反应；法氏囊：结构清晰，淋巴细胞核完整，无明显病变；脾脏：脾脏结构完整，无明显病变，红髓区与白髓区分界明显，淋巴细胞结构清晰；心脏：心肌纤维结构完整，胞核结构清晰，心肌纤维无炎性反应.

表5　三种中药复方对雏鸡免疫器官指数的影响

A:肝脏； B：法氏囊；C：脾脏；D：心脏.图1　雏鸡的组织学变化Fig.1　Histological changes of chicken

3讨论

3.1　中药复方对雏鸡免疫功能的影响

根据现代药理学研究，白术、黄芪、党参、防风等中药中均含有大量的多糖等生物有效成分，它们能快速活化机体免疫系统，增加免疫活性细胞的数量并增强其功效[7-8].杨丽平等[9]报道，石榴皮能提高抗体效价.胡元亮等[10]报道，黄芪、党参等中药能提高ND抗体效价，延长其在体内的存留时间.胡晓蕾等[11]报道，中草药白术能够增强脾脏的功能，并提高T、B淋巴细胞增殖转化的能力.高鸿霞等[12]报道，防风可明显提高LPS诱导的脾T、B细胞增殖.Kim等[13]研究发现，IFN-γ能显著增强抗原特异T细胞介导的免疫反应.因此，本研究选用黄芪、白术、防风等中草药配伍组方饲喂实验组鸡，通过对不同日龄试验组鸡体液免疫和细胞免疫指标的检测，发现3种组方胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数均显著高于对照组，表明3种中药复方均能显著增强机体免疫功能，而且Ⅱ组(扶正止泻散组)抗体效价、淋巴细胞转化等方面显著高于其他2组[14].

3.2　中药复方对雏鸡免疫器官及的其他组织发育的影响

胸腺、法氏囊和脾脏是禽类最重要的免疫器官，其发育状态及机能强弱直接决定着禽类的免疫水平[15-16].Rivas 等[17]指出，胸腺、法氏囊和脾脏的质量可用于评价雏鸡的免疫状况.同时有学者认为免疫器官指数降低为免疫抑制所致，而其指数增加则为免疫增强的表现[18].本试验结果显示，3个中药复方对雏鸡免疫器官组织结构清晰，胸腺、法氏囊发育良好，无明显衰老症状，这与仇微红等[19-20]的研究结果相似，提示3种中药复方具有延缓胸腺、脾脏和法氏囊退化的功效.

3.3　中药复方在家禽生产中的应用前景

本研究检测结果显示：Ⅰ组(扶正止泻散基础方组)和Ⅱ组(扶正止泻散组)在不同日龄时的细胞免疫和体液免疫各项指标均显著高于对照组(P<0.01)，而Ⅲ组(芪术扶正汤)与对照组差异显著(P<0.05)，提示中草药及其主要活性成分具有广泛的免疫调节功能，能多靶点、多途径、多水平地调节机体免疫功能.同时因中草药具有天然安全、资源丰富的特点，常被用作保健食品和药品用于防治肿瘤或免疫性相关的疾病，发挥免疫调节剂的作用[21].但目前它们免疫调节的直接作用靶点及其在体内的吸收、分布和药理作用机制尚不清楚.因此，深入探索和挖掘中草药对免疫系统调节的药理及作用机制，将在临床应用和免疫预防方面都具有重要价值.

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(责任编辑胡文忠)

Effects of three traditional Chinese medicine prescriptions on the immune organ development and immune function of chicken

YANG Run-xia1,WU Run1,LIU Lei1,KOU Xiao-jing2,WEI Jiao1,WANG Yu-long1

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Gansu Animal

Epidemic Disease Control Center,Lanzhou 730046,China)

Abstract：This experiment was carried out to explore the effects of traditional Chinese medicines on the immune function and immune organ development of chicken.Three Chinese herbal medicine compound preparations were made by using Astragalus membranaceus,Atractylodes macrocephala,Saposhnikovia divaricata,Scutellaria baicalensis and gallnut.Meanwhile,120 one-day-old chicks were divided into 4 groups,and detected at the ages of 42,52 and 62 days.The detected immune parameters were T lymphocytes,chicken γ- interferon,antibody titers and immune organ indexes,and the tissue sections and HE staining were also done.The results showed that the T lymphocytes ANAE positive rate,antibody titers and γ-IFN levels of the experimental groups were significantly higher than those of control group(P<0.01),and those of groupsⅠand Ⅱwere higher than those of group Ⅲ.The immune organ indexes and the blood cells number of experimental groups were significantly higher than those of control group(P<0.01 or P<0.05),and those of groupⅡ were higher than those of groupⅠ.The observation results of tissue sections showed that each organ structure without obvious lesions.The experiment indicated that three Chinese herbal medicine compound preparations had positive effects on immune function of chicken,and could improve the immune function of body's cell and humor,and the effects of groupⅡ was the most obviously.

Key words：chicken;Chinese herbal compound;immunologic function;organ development;tissue sections

收稿日期：2014-09-03；修回日期：2014-10-15

基金项目：甘肃省农业科技专项农业科技示范基地建设项目“中草药抗畜禽常见传染病作用的研究与应用”(0623006).

通信作者：吴润，教授，博士生导师，主要从事兽医微生物学及免疫学的研究与教学工作.E-mail：wurun@gsau.edu.cn

中图分类号：S 853

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)04-0028-06