十三种中药水煎液体外抗鸡新城疫病毒的研究

豆艳丽，吴润，刘磊，钱续

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　730070；2.榆中县畜牧水产技术推广中心,甘肃 榆中　730100)

十三种中药水煎液体外抗鸡新城疫病毒的研究

豆艳丽1,2，吴润1，刘磊1，钱续2

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070；2.榆中县畜牧水产技术推广中心,甘肃 榆中730100)

摘要：鸡新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是危害家禽生产的重要病毒之一.试验选取黄芪、紫胡、金银花、野菊花、黄芩、藿香、芦根、细辛、栀子、甘草、马鞭草、鱼腥草、大青叶13种中药的提取液在传代细胞系鸡胚成纤维细胞(DF-1)上进行抗NDV试验，通过细胞病变效应(CPE)和噻唑蓝活细胞染色法(MTT)，检测13种中药提取液分别对正常DF-1的细胞毒性以及NDV感染DF-1细胞的预防、治疗和直接灭活作用.结果表明：黄芪、野菊花、马鞭草和细辛提取液对NDV有显著地直接灭活作用；黄芪、金银花、野菊花和细辛提取液有显著的阻断NDV吸附作用；黄芪、金银花、野菊花和马鞭草提取液具有显著抑制NDV生物合成作用；综合以上结果说明黄芪、金银花、野菊花、马鞭草和细辛提取液的抗NDV作用较好.为抗NDV中药研究和临床用药提供了相关的试验数据.

关键词：鸡新城疫病毒；中药；给药模式；抑制作用；

第一作者：豆艳丽(1987-)，女，硕士研究生，主要从事畜牧兽医技术推广工作.E-mail:douyl@126.com

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病，是目前危害我国养禽业健康发展的重要疾病之一[1]，临床防治无特效药物[2]，主要以免疫接种和紧急接种防控为主.中药作为天然产物，保持了各种成分的自然性和生物活性，在动物体内易吸收易代谢，具有诱生干扰素、抗病毒、增强机体免疫力的功效[3-4]，因此，中药成为当前生产绿色动物食品的有益添加剂和防治畜禽疾病的首选药物.鉴于此，本研究选取临床抗呼吸道病毒有较好作用的中药，对其体外抗NDV作用进行了研究.通过13种中药水煎液对感染NDV的传代细胞系鸡胚成纤维细胞(DF-1)保护效果的考察，以期评价不同中药在DF-1上对NDV增殖的抑制作用，为进一步发掘和研发高效低毒的抗病毒中药制剂提供科学依据.

1材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1病毒与细胞NDV由甘肃农业大学动物医学院微生物实验室保存，接种10日龄鸡胚复壮病毒，收集病毒液-20 ℃保存；鸡胚成纤维细胞系(DF-1)由中国农业科学院上海兽医研究所提供.

1.1.2中药黄芪(Radixastragali)、柴胡(Bupleurichinensis)、金银花(Loniceraejaponica)、野菊花(Dendranthemaindicum)、黄芩(Scutellariabaicalensis)、藿香(Agastacherugosa)、芦根(Rhizomaphragmitis)、大青叶(Isatidisindigotica)、细辛(Asarumsieboldii)、栀子(Gradeniaejasminoides)、甘草(Glycyrrhizaeuralensis)、马鞭草(Verbenaeoffcinalis)、鱼腥草(Houttyniacordata)，购自兰州安泰堂中药饮片有限公司，由甘肃农业大学动物医学院杨致礼副教授鉴定.

1.1.3细胞培养液犊牛血清(FBS)、DMEM、青霉素(800 000 IU)、链霉素(1 600 000 IU)、胰酶、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)；D-Hanks、0.25%胰酶、双抗配制方法参照文献[1].细胞完全培养液：含10% FBS、1%双抗(10 000 IU/mL)DMEM营养液；细胞维持液：含2% FBS、1%双抗(10 000 IU/mL)DMEM营养液.

1.2　试验方法

1.2.1中药提取液的制备称取13种中药各1 g，分别放入小烧杯(100 mL)中，加20倍体积的双蒸水，浸泡30 min，加热至沸腾后文火煎煮15 min，滤纸过滤除去沉渣，如此反复3次，合并滤液，浓缩至10 mL(即1 mL水提液相当于含生药量0.1 g)，115 ℃高压灭菌20 min.13种中药水煎液均4 ℃保存备用.

1.2.2中药对DF-1细胞毒性的测定用细胞维持液将中药药液递倍稀释成10个梯度，即100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20 mg/mL，接种至已经长成单层DF-1细胞的96孔细胞板上，接种量为100 μL/孔，每质量浓度重复4孔，补加细胞维持液100 μL，并设细胞对照组和中药对照组.置于5% CO2、37 ℃温箱中培养72 h，每日观察感染细胞圆缩、脱落等细胞病变(Cytopathic effect,CPE)，确定细胞不出现CPE的最低稀释倍数为受试中药的最大安全浓度(TC0).

1.2.3NDV的毒力测定采用微量细胞培养法测定半数细胞感染剂量(TCID50)，对病毒液进行10倍梯度稀释，接种于长满单层DF-1细胞的96孔细胞板上，每孔100 μL，每质量浓度重复8孔，同时设病毒对照和细胞对照.37 ℃孵育1 h后补加维持液100 μL，置5% CO2、37 ℃温箱72 h，逐日观察CPE，以72 h CPE达50%以上病变的孔为阳性孔，记录发生CPE和未发生CPE的孔数，按照Reed-Muench法[1]计算病毒的TCID50.

1.2.4中药体外抗NDV试验

1.2.4.1中药对NDV的直接灭活作用以中药TC0为起点，药液递倍稀释成10个梯度，将上述不同质量浓度的药液与100TCID50的NDV病毒液(体积比：1∶1)混合后37 ℃作用1 h，接种于长满单层DF-1细胞的96孔细胞板上，每孔200 μL，每质量浓度重复4孔，并设病毒对照(只加200 μL100TCID50的NDV病毒液)和细胞对照(只加200 μL的细胞维持液)，置于5%CO2、37 ℃温箱培养72 h.

1.2.4.2中药对NDV吸附细胞的阻断作用依据1.2.4.1方法稀释药液，将不同质量浓度的药液加入已长满单层DF-1细胞的96孔细胞板上，每孔100 μL，每质量浓度重复4孔，置于5%CO2、37 ℃温箱孵育1 h，之后以100 μL100TCID50的NDV病毒液攻击细胞.并设病毒对照和细胞对照，置5%CO2、37 ℃温箱培养72 h.

1.2.4.3中药对NDV生物合成的抑制作用将100TCID50的NDV病毒液加入已长满单层DF-1细胞的96孔细胞板上，每孔100 μL，每质量浓度重复4孔，置于5%CO2、37 ℃温箱孵育1 h，之后补加不同质量浓度的药液100 μL.并设病毒对照和细胞对照，置5%CO2、37 ℃温箱培养72 h.

1.2.4.4评判方法采用MTT活细胞染色法[5]，选择630 nm波长酶标检测仪测定各孔吸光度(D630)，同时设中药颜色对照组，二者之差即为实际活细胞D630值.经统计学分析中药的最小有效浓度，并以抑制指数(inhibition index,TI)为标准衡量中药对病毒的抑制效力，TI值越大，中药抑制病毒的作用越强[6].

抑制指数(TI)=最大无毒质量浓度/最小有效质量浓度

2结果与分析

2.1　中药对DF-1细胞的毒性作用

在受试期间内，正常对照细胞孔形态正常，中药组对细胞具有毒性，质量浓度越大细胞毒性越强，引起细胞皱缩、融合、脱落，不同中药所致的细胞毒性存在差异，藿香、芦根、细辛、马鞭草对DF-1的毒性最小，TC0均为25 mg/mL；黄芪、柴胡、金银花、黄芩、大青叶、栀子、鱼腥草的TC0均为6.25 mg/mL，野菊花、甘草的TC0均为12.5 mg/mL.

2.2　NDV的TCID5 0测定

根据NDV所致CPE阳性孔和阴性孔的数目，按照Reed-Muench法计算NDV的感染效价(TCID50)，测得TCID50为10-6.5/0.1mL.

2.3　不同中药的体外抗病毒作用

2.3.1中药对NDV的直接灭活作用受试时间内正常对照细胞形态均正常，MTT检测结果见表1.中药水煎液质量浓度越大，对NDV的直接灭活作用越强，其中黄芪、野菊花、马鞭草、细辛对NDV的直接灭活作用最强，有效抑制质量浓度为1/16TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为16；金银花、黄芩对NDV的直接灭活作用次之，有效抑制质量浓度为1/8TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为8；柴胡、藿香、芦根、甘草对NDV的直接灭活作用较弱，有效抑制质量浓度为1/4TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为4；其余被试中药对NDV的抑制作用很弱(TI≤2).

表1　中药对NDV的直接灭活作用(n=13)

同列数据肩标不同字母者表示差异显著(P<0.05)；与病毒对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01).

2.3.2中药对NDV吸附细胞的阻断作用受试时间内正常对照细胞形态均正常，MTT检测结果见表2.中药水煎液质量浓度越大，对NDV吸附细胞的阻断作用越强，黄芪、金银花、野菊花、细辛对NDV的阻断作用最强，有效抑制质量浓度为1/16TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为16；柴胡、马鞭草对NDV的阻断作用次之，有效抑制质量浓度为1/8TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为8；黄芩、芦根对NDV的阻断作用较弱，有效抑制质量浓度为1/4TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为4；其余被试中药对NDV的抑制作用很弱(TI≤2).

2.3.3中药对NDV生物合成的抑制作用受试时间内正常对照细胞形态均正常，MTT检测结果见表3.中药水煎液质量浓度越大，对NDV生物合成的抑制作用越强，黄芪、金银花、野菊花、马鞭草对NDV生物合成的抑制作用最强，有效抑制质量浓度为1/16TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为16；柴胡、藿香、细辛对NDV的抑制作用次之，有效抑制浓度为1/8TC0(P<0.05或P<0.01)，TI为8；其余被试中药对NDV的抑制作用很弱(TI≤2).

表2　中药对NDV吸附细胞的阻断作用(n=13)

同列数据肩标不同字母者表示差异显著(P<0.05)；与病毒对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01).

表3　中药对NDV合成复制的阻断作用(n=13)

同列数据肩标不同字母者表示差异显著(P<0.05)；与病毒对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01).

3讨论

1)MTT活细胞染色法是体外常用的一种筛选抗病毒中药的方法，该方法通过测定吸光度(OD)间接反应活细胞存活率，具有灵敏度高、简便快速的优点[7].本研究利用NDV在其种属来源相同的DF-1传代细胞系中更适宜增殖的特性[8]，首先体外培养DF-1传代细胞系，通过MTT活细胞染色法在630nm波长酶标检测仪测定各孔D630，以间接评价各种中药对NDV的活性，同时试验组设定了中药颜色对照组，数据统计时扣除中药颜色的影响，以准确评价中药对NDV的抑制作用[9]，使试验数据更具科学性.

2)中药抗病毒的机理较复杂，主要通过提高免疫细胞的粘附、诱生干扰素、抑制病毒基因组复制、保护靶细胞等途径来抑制病毒增殖[10-12]，针对此特性试验设置了中药直接灭活病毒、抗病毒吸附和抗病毒生物合成3个试验组，结果表明中药直接灭活NDV作用最强的是黄芪、野菊花、马鞭草、细辛，抗NDV吸附作用最强的是黄芪、金银花、野菊花、细辛，抗NDV生物合成作用最强的是黄芪、金银花、野菊花、马鞭草，可见中药与NDV的作用方式不同，其有效成分抗病毒活性有差异.有研究表明黄芪多糖(APS)在质量浓度为1 000、500 μg/mL具有显著的抗NDV吸附的作用，在质量浓度为125 μg/mL时无抗NDV吸附作用，质量浓度为125μg/mL时具有抑制NDV生物合成的作用[13].

3)中药抗病毒的基本原理是扶正祛邪，其有效成分通过抑制病毒增殖的某一环节或增强机体的免疫力来发挥作用.近年来，对中药抗病毒的具体有效成分报道较多，如多糖类、皂苷类、黄酮类、咖啡酰奎宁酸类、生物碱类等[13].有研究表明黄芪、野菊花、金银花中抗NDV的有效活性成分分别是多糖、黄酮类、有机酸类(绿原酸)[14-15]，本研究也证实黄芪、野菊花和金银花提取液有较强的抗NDV作用.细辛的挥发油成分具有抗人乳头瘤病毒的作用[16]，马鞭草能够抑制乙肝病毒[17]，但二者抗NDV及其他禽类病毒未见相关报道.因此对于细辛、马鞭草抗NDV的有效成分及药理作用有待进一步研究.

通过黄芪、大青叶等13种中药提取液对NDV感染DF-1细胞的预防、治疗和直接灭活试验，结果表明黄芪、金银花、野菊花、马鞭草和细辛提取液具有抗较好的抗NDV作用，为抗NDV中药研究和临床用药提供实验依据.

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(责任编辑赵晓倩)

Study of thirteen traditional Chinese medicines anti-newcastle disease virusinvitro

DOU Yan-li1,2,WU Run1,LIU Lei1,QIAN Xu2

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Animal Husbandry

and Fisheries Technology Promotion Center of Yuzhong,Yuzhong 730100,China)

Abstract：To study the inhibiting effects of traditional Chinese medicines (TCM) against the Newcastle Disease Virus (NDV) in DF-1 cell lines,the study using tissue cell culture method and MTT assay to investigate thirteen TCM on the cytotoxicity,antiviral effects by different subtype of prophylaxis,therapy and direct action.The result showed that water extract from Mongolian Milkvetch Root,Wild Dendranthema Flower,European Verbena Herb,Manchurian Wild ginger Herb killed virus.The water extract of Mongolian Milkvetch Root,Japanese Honeysuckle Flower Bud,Wild Den-dranthema Flower,Manchurian Wild ginger Herb were preventive virus adsorbing cell.The water extract of Mongolian Milkvetch Root,Japanese Honeysuckle Flower Bud,Wild Dendranthema Flower,European Verbena Herb inhibited biosynthesis of virus.The study suggests that the Mongolian Milkvetch Root,Japanese Honeysuckle Flower Bud,Wild Dendranthema Flower,European Verbena Herb,Manch-urian Wild ginger Herb have the effect of anti-NDV in vitro.

Key words：Newcastle disease virus;traditional Chinese medicines;administration pattern;inhibitory action

收稿日期：2014-05-15；修回日期：2014-06-08

基金项目：甘肃省农业科技专项农业科技示范基地建设项目(06223006).

通信作者：刘磊，男，教授，硕士生导师，主要从事兽医微生物与免疫学研究.E-mail:liul@gsau.edu.cn

中图分类号：S 831.7;R 285

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)04-0023-05