响应面法优化白藜芦醇β环糊精包合物的制备工艺

陈 帅,王慧竹,钟方丽,*,赵月蓉

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳 110061)



响应面法优化白藜芦醇β环糊精包合物的制备工艺

陈 帅1,2,王慧竹1,钟方丽1,*,赵月蓉1

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳 110061)

本研究以优化白藜芦醇包合物的制备工艺,及包合物的形成进行验证为研究目的,在单因素实验基础上,以包合率和得率的总评归一值为考察指标,采用响应面法优化包合物的制备工艺,并采用差示扫描量热法对包合物的形成进行验证。实验结果表明白藜芦醇包合物最佳制备工艺条件为β环糊精与白藜芦醇投料比(摩尔比)2∶1、包合温度40℃、包合时间63min。差示扫描量热法分析结果显示白藜芦醇β环糊精包合物已形成。

白藜芦醇,β环糊精,包合物,响应面法

白藜芦醇(resveratrol,RES)化学名为3,4′,5-三羟基-1,2-二苯乙烯,是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物[1],是植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素[2],广泛分布葡萄、虎杖、花生、桑葚、蓝莓和云杉等植物的根、茎、叶、果实中[3]。RES具有广泛的生物活性,如抗氧化、保护心血管、抗癌、保护肝脏等药理作用[4],近年来有学者研究发现RES还具有延缓衰老的药理作用[5]。但RES水溶性低[6]、不稳定[7]、生物利用度低的性质使其在临床上的应用受到了限制,因此提高其水溶性及稳定性是拓宽其应用范围的关键,将RES制成环糊精包合物,可以增加其在水中的溶解度。目前,有关RES环糊精包合物的研究主要集中在RES羟丙基环糊精的制备及性质研究方面[8-10],经文献检索未见关于响应面法优化白藜芦醇β环糊精包合物制备工艺的报道。为此,本课题采用饱和水溶液法[11]制备了白藜芦醇β环糊精包合物,并利用响应面法优化包合物的制备工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇原料药 西安一禾生物技术有限公司,批号20131126；β环糊精 天津市大茂化学试剂厂；白藜芦醇对照品(纯度≥98%,HPLC) 成都曼斯特生物科技有限公司(批号MUST-11050301),其它试剂均为分析纯,蒸馏水为自制。

TU-1950型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Q2000型差示扫描量热仪 美国TA仪器公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；AUY220型电子分析天平 日本岛津公司；DF-101S型恒温磁力搅拌器 金坛市威盛实验仪器厂；DFZ-6050型真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇标准曲线的制备 精密称取2.0mg RES对照品置于25mL容量瓶中,用30%甲醇溶解,定容,得0.08mg·mL-1的对照品溶液,分别精密移取上述对照品溶液1、1.5、2、2.5、3、3.5mL置于10mL容量瓶中,用30%甲醇定容,摇匀。以30%甲醇为对照,在305nm处分别测吸光度,然后以浓度C为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为A=142.69C+0.036,R2=0.9973,线性范围8～28μg·mL-1。

1.2.2 白藜芦醇β环糊精包合物的制备 按确定投料比准确称取RES和β环糊精,其中RES用少量30%乙醇溶解,将β环糊精在恒温条件下制成饱和溶液,然后将RES逐滴加入到β环糊精饱和溶液中,在恒温条件下按既定的时间进行包合。冷却后置冰箱中冷藏12h,抽滤,滤饼用少量乙醇洗涤3次,洗去未被包合的RES,滤饼置60℃真空干燥箱中干燥,粉碎后即得白色包合物粉末,称重[12],按式(1)计算包合物的得率。

包合物得率(%)=包合物的质量/(β环糊精质量+白藜芦醇投料质量)×100

式(1)

1.2.3 包合物包合率的测定 精密称取白藜芦醇包合物适量(相当于RES 4mg),置于50mL容量瓶中,用30%乙醇溶解,定容,摇匀,移取2mL置于10mL容量瓶中,用30%甲醇定容,在305nm处测定样品的吸光度,根据回归方程求得白藜芦醇浓度,从而求出白藜芦醇β环糊精包合物中RES的含量,按式(2)计算包合率。

包合率(%)=包合物中白藜芦醇质量/白藜芦醇投料量×100

式(2)

1.2.4 白藜芦醇包合物的验证 分别取白藜芦醇、β环糊精、白藜芦醇β环糊精包合物、白藜芦醇和β环糊精混合物进行差示扫描量热分析,具体操作条件如下:AI标准盘,测试氛围N2(99.99%),流速50mL·min-1,测试前仪器样品池在N2下稳定2h,样品装样量2.0mg,升温速率10.00℃·min-1,扫描温度范围为50～350℃,分别记录样品的差示扫描升温曲线。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 投料比对包合率和包合物得率的影响 准确称取5份RES原料药,每份1.0g,分别以5mL乙醇溶解,然后分别按β环糊精与RES物质量比1∶2,1∶1,2∶1,3∶1,4∶1称取相应质量的β环糊精置于锥形瓶中,定量加入蒸馏水,在温度30℃条件下制成饱和溶液,将RES缓慢加入上述饱和溶液中,固定包合时间为60min,按“1.2.2”项下方法制备包合物,并根据“1.2.1”项下方法测定吸光度,计算包合率和包合物得率。

1.2.5.2 包合温度对包合率和包合物得率的影响 准确称取5份RES原料药,每份1.0g,分别以5mL乙醇溶解,另取5份β环糊精,每份9.96g,置于100mL锥形瓶中,定量加入蒸馏水,分别于10,20,30,40,50℃下制成饱和溶液,将白藜芦醇缓慢加入上述饱和溶液中,固定包合时间为60min,按“1.2.2”项下方法制备包合物,并根据“1.2.1”项下方法测定吸光度,计算包合率和包合物得率。

1.2.5.3 包合时间对包合率和包合物得率的影响 准确称取5份RES原料药,每份1.0g,分别以5mL乙醇溶解,另取5份β环糊精,每份9.96g,置于100mL锥形瓶中,定量加入蒸馏水,在温度30℃下制成饱和溶液,将白藜芦醇缓慢加入上述饱和溶液中,在恒温条件分别搅拌30,40,50,60,70min进行包合,按“1.2.2”项下方法制备包合物,并根据“1.2.1”项下方法测定吸光度,计算包合率和包合物得率。

1.2.6 包合物制备工艺最优参数的确定 以RES包合物包合率和得率为评价指标,依次改变β环糊精与RES投料比(X1),包合温度(X2)及包合时间(X3)进行单因素实验,并确定三因素三水平的最佳参数进行响应面分析,实验设计中的水平及编码值见表1。

表1 实验因素水平编码表Table1 Code Tableof experimental factors and levels

1.2.7 响应面实验设计 在单因素实验基础上确定β环糊精与RES投料比(X1),包合温度(X2)及包合时间(X3)作为响应面实验的自变量,根据星点设计的原理[13-14],每个因素设3个水平,用代码值-1,0,1表示,代码值所代表的实际物理量如表1所示,以包合物的包合率(Y1)和得率(Y2)为考察指标进行响应面实验。为了将包合率(Y1)和得率(Y2)综合为一个能反映总体效应结果的值,数据处理采用归一化法[15],分别对Y1和Y2进行数学转换求“归一值”(OD),计算公式如下:

di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)

式(3)

式中：di表示表2中第i个考察指标(Yi)项下各归一值,yi表示表2中第i个考察指标(Yi)项下各具体数值,ymin表示表2中第i个考察指标(Yi)项下最小值,ymax表示表2中第i个考察指标(Yi)项下最大值。

计算出各指标项下的di值后,对各指标“归一值”进行处理,得总评“归一值”(OD),计算公式如下:

OD=(d1×d2…dn)1/n

式(4)

式中:dn表示表2中相同实验序号后的第i个考察指标(Yi)项下归一值(n=i),n表示考察指标的个数。

1.2.8 数据统计分析 利用软件Origin8.5对单因素实验结果进行处理,用SAS9.4软件对响应面实验进行设计并处理相关数据。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 投料比对包合率和包合物得率的影响 投料比对包合率和包合物得率的影响结果如图1所示。

图1 投料比对包合率和得率的影响Fig.1 Effect of feed ratio on inclusion rate and yield

从图1可以看出,包合物的包合率和得率开始随投料比增大而增大,投料比为2∶1时包合物的包合率和得率均达到最大值,之后随着投料比的继续增大,包合率和得率均呈现减小趋势。为了进一步考察投料比对包合率和得率的影响,分别选择投料比1∶1,2∶1,3∶1进行星点设计-响应面实验。

2.1.2 包合温度对包合率和包合物得率的影响 包合温度对包合率和包合物得率的影响结果如图2所示。

图2 包合温度对包合率和得率的影响Fig.2 Effect of inclusion temperature on inclusion rate and yield

从图2可以看出,开始阶段随着包合温度的升高,包合物率和得率逐渐增大,当包合温度为40℃时,包合率和得率均达到最大值,之后随温度的继续升高包合率和得率反而下降,可能是因为β环糊精与RES包合与脱包合是一动态平衡过程,适当的温度有利于主体分子与客体分子结合成包合物,温度太高则由于分子热运动加剧,导致包合物脱包合,重新恢复主客体分子单独运动的状态。为了进一步考察包合温度对包合率和得率的影响,选择30,40,50℃进行星点设计-响应面实验。

2.1.3 包合时间对包合率和包合物得率的影响 包合时间对包合率和包合物得率的影响结果如图3所示。

图3 包合时间对包合率和得率的影响Fig.3 Effect of inclusion time on inclusion rate and yield

从图3可以看出,包合率和得率随包和时间的延长逐渐增大,当包合时间为60min时包合率和得率均达到最大值,之后随包合时间的继续延长,包合率和得率略有下降,可能是因为包合过程是客体分子进入到主体分子空腔内并以分子间氢键结合的过程,包合时间延长有利于主客体分子的充分接触,有利于包合的形成,但由于包合物形成为一动态过程,过长的时间会导致部分包合物脱包合。为了进一步考察包合时间对包合率和得率的影响,选择50,60,70min进行星点设计-响应面实验。

2.2 包合物的验证

利用DSC法对包合物的形成进行验证,结果如图4所示。

从图4可以看出RES原料药的DSC曲线在265.09℃时有一个尖的内热峰,为RES的熔化峰,β环糊精的DSC曲线在305.41℃时有一个尖的内热峰,为β环糊精的熔化峰,而包合物DSC曲线上RES和β环糊精的内热峰均消失,并且在253.71℃处出现了新的内热峰,物理混合物DSC曲线基本上是白藜芦醇原料药和β环糊精DSC曲线的叠加,只是主药峰的高度略有降低,说明物理混合物在物理混合过程中可能有少量药物被包合,因此判断白藜芦醇包合物已经形成。

图4 白藜芦醇包合物的差示扫描热分析(DSC)图Fig.4 Differential scanning calorimetry(DSC)diagram of RES注：A. RES原料药；B. β环糊精；C.包合物；D. 物理混合物。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计结果 响应面实验结果如表2所示。

表2 星点实验设计及结果Table2 Result of central composite design

2.3.2 响应面分析 对表2数据进行多元二次方程拟合,得回归方程:

OD=-8.015+0.969X1+0.0923X2+0.222X3-6.07X1X2-0.0049X1X3-0.00024X2X3-0.133X12-0.00167X22-0.00166X32(R2=0.8271,Pr>F值为0.00206)

利用软件SAS 9.4对上述拟合方程的系数显著性进行检验和方差分析,结果如表3和表4所示。

表3 回归系数显著性检验Table3 Test of significance of regression coefficient

注：*为显著(p<0.05),**为高度显著(p<0.01)。

表4 回归方程的方差分析Table4 Analysis of variance of regression model

注：*为显著(p<0.05),**为高度显著(p<0.01)。 由表3可知方程的一次项中仅有X3项影响显著,交互项影响不显著,二次项X12,X22,X32影响显著,其中X32影响高度显著,说明各因素对响应值的影响不是简单的线性关系[16]。

由表4可知,回归方程的二次项对响应值的影响显著；模型的Pr>F值为0.0016,差异显著,失拟项Pr>F值大于0.05,影响不显著,说明无失拟因素存在,方程决定系数R2为0.8271,说明响应值的变化有82.71%来源于所选变量[17]。

为了更加直观表达两个因素同时对总评值的影响,以回归方程为分析及预测模型,固定任意一个因素的值为中值,考察其它两个因素对总评值的影响,绘制响应曲面图[18-19],结果如图5～图7所示。

图5 投料比和包合温度对总评值影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of the effect of feed ratio and inclusion temperature on OD

图6 投料比和包合时间对总评值影响的响应面图Fig.6 Response surface plots of the effect of feed ratio and inclusion temperature on OD

图7 包合时间和包合温度对总评值影响的响应面图Fig.7 Response surface plots of the effect of inclusion time and inclusion temperature on OD

图5显示当固定包合时间时,随着投料比和包合温度的升高,总评值呈现先增大后减小的趋势,从等高线图可以看出,包合温度相对投料比对总评值的影响更大；图6显示当包合温度固定时,随着投料比和包合时间的延长,总评值呈现先增大后减小的趋势,但从等高线图上可以看出包合时间相对投料比对总评值的影响更大；图7显示固定投料比时,随着包合温度和包合时间的延长,总评值呈现先增大后减小的趋势,但从等高线图上可以看出包合时间相对包合温度对总评值的影响更大。因此对总评值影响最大的因素是包合时间,其次为包合温度,影响最不显著的为投料比,这与回归系数显著性检验结果一致。

利用SAS软件的RSREG语句对模型进行典型性分析[20],得到白藜芦醇包合物制备的最佳工艺为:投料比为2.08∶1、包合温度39.56℃、包合时间62.94min,在此工艺条件下包合率和得率的总评预测值为0.76,考虑到实际情况,将最佳工艺条件修正为投料比为2∶1、包合温度40℃、包合时间63min。

2.3.3 最优包合工艺的验证 按最佳工艺条件重复3次实验进行验证,结果显示包合率为46.53%,包合物得率为50.85%,总评归一值为0.7431,预测值为0.7607,证明拟合模型较好地反映工艺中各因素与评价指标之间的关系,且稳定可靠。

3 结论

本研究采用饱和水溶液法制备白藜芦醇β环糊精包合物,并利用响应面法对包合工艺进行了优化,结果表明白藜芦醇β环糊精包合物最佳制备工艺条件为:β环糊精和白藜芦醇投料比(摩尔比)为2∶1,包合温度为40℃,包合时间为63min。经差示扫描量热法验证包合物已经形成。本实验通过响应面法优化出的白藜芦醇β环糊精包合物的最佳制备工艺稳定,可靠,为白藜芦醇新制剂的研究开发提供了理论依据。

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Optimization of the preparation process of resveratrol β cyclodextrin inclusion compound by response surface methodology

CHEN Shuai1,2,WANG Hui-zhu1,ZHONG Fang-li1,*,ZHAO Yue-rong1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Teconology,Jilin 132022,China；2.School of pharmacy,Shenyang Pharmacetical University,Shenyang 110061,China)

The aim of the experiment was to optimize the preparation process of resveratrol inclusion compound. Based on the single factor test,response surface experiment was carried out to optimize the preparation process of resveratrol inclusion compound with overall desirability of inclusion rate and yield as appraisement criteria. The formation of inclusion compound was validated utilizing differential scanning calorimetry. The result showed that the optimum preparation process of resveratrol inclusion compound was as follows:the feed ratio of β cyclodextrin and resveratrol(molar ratio)2∶1,inclusion temperature 40℃,inclusion time 63min. And the analysis result of differential scanning calorimetry indicated that resveratrol inclusion compound had formed.

resveratrol;β cyclodextrin;inclusion compound;response surface methodology

2014-10-11

陈帅(1982-)，男，硕士，研究方向:中药制剂分析。

*通讯作者:钟方丽(1970-)，女，博士，教授，研究方向：天然产物的提取分离。

吉林化工学院科技项目(吉化院合字[2011]第30号)。

TS201.1

B

:1002-0306(2015)09-0255-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.047