富含γ氨基丁酸的发酵糙米米粉工艺研究

张 珺,何义雁,朱香燕,吴卫国

(湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128)



张 珺,何义雁,朱香燕,吴卫国*

(湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128)

利用响应面分析法对植物乳杆菌接种的发酵糙米米粉发酵工艺进行研究。以γ-氨基丁酸含量为响应指标,以发酵时间、接种量、发酵温度为单因素考察指标,在Box-Behnken实验设计原理的基础上采用三因素三水平的响应面分析法研究了各因素的显著性及交互作用。确定的最佳发酵条件为:发酵时间52h、接种量2%、发酵温度40℃。此条件下的发酵样γ-氨基丁酸的含量为3.14mg/g,与预测值的相对误差为0.8%,加工成型后的糙米粉γ-氨基丁酸含量为2.92mg/g。

响应面分析,γ-氨基丁酸,植物乳杆菌,糙米米粉,发酵

近年来,糙米作为一种富含多种活性功能成分的粗粮活跃于食品加工领域,主要的糙米制品有糙米饼、糙米饮料、糙米茶等。糙米中活性物质含量丰富,主要有γ-氨基丁酸、谷维素、抗性淀粉、烷基间苯二酚、维生素B等[1]。为达到资源的充分利用,活性物质的充分保留,有研究将糙米先进行发芽处理再加工,这样既能极大保留甚至提高糙米中的活性物质,又能解决糙米口感粗糙的问题[2]。除此之外,通过接种植物乳杆菌对糙米采用乳酸发酵处理,不仅能大大改善糙米的加工性能[3],还能提高其中活性成分尤其是γ-氨基丁酸的含量[4],以此加工的糙米米粉还具有令人愉快的发酵风味。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛存在于高等植物和藻类植物中的四碳非蛋白类氨基酸,是一种主要的中枢系统神经递质抑制剂[5],具有降血压[6]、利尿[7]、安定神经[8]、抗癌[9]等生理功能。接种植物乳杆菌的糙米进行乳酸发酵的过程中产生了谷氨酸脱羧酶,这种酶能够使谷氨酸发生不可逆脱羧反应,生成大量的γ-氨基丁酸[10]。

本实验目的在于采用响应面法优化植物乳杆菌发酵糙米米粉工艺,以发酵过程中γ-氨基丁酸的含量为响应指标,得到一种富含γ-氨基丁酸的发酵糙米米粉。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糙米 湖南省长沙县;GABA标准品 Adamas公司;植物乳杆菌 湖南农业大学食品科学技术学院重点实验室;MRS肉汤培养基,无菌水,60%乙醇;7.5%次氯酸钠(v/v,有效氯≥10%);6%重蒸苯酚(v/v);0.1mol/L四硼酸钠缓冲溶液。

YXQ-LS-50SII高压灭菌锅 上海晓科科学仪器有限公司;JB-FY-1300IIU无菌操作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司;SPX系列生化培养箱 常州欧邦电子有限公司;7200可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;101A-3ET电热鼓风干燥箱 上海实验仪器有限公司;打浆机 九阳股份有限公司;蒸锅 浙江苏泊尔股份有限公司;培养皿、三角瓶等玻璃器皿若干。

1.2 实验方法

1.2.1 GABA测定方法 GABA标准曲线的绘制[11]:以60%乙醇为溶剂,准确配制0.01、0.04、0.1、0.25、0.5mg/mL GABA标准品。分别取3mL以上浓度的标准试液,每组添加6mL次氯酸钠,2mL苯酚溶液,并用四硼酸钠调pH9.0,避光放置30min后于635nm处测定吸光度。得到GABA的标准曲线方程为y=4.554x+0.1283,R2=0.974,y为吸光度,x为GABA标准品浓度。

样品中GABA测定方法:取10g发酵糙米米浆,以1∶3的料液比加入60%的乙醇作为提取剂,60℃下持续振荡2h,取出冷却、过滤得到GABA提取液。取3mL提取液按以上标准曲线测定方法测定吸光度;同时,取出同一发酵批次的米浆进行水分的测定。最后根据吸光度值及水分含量值计算出发酵样中GABA含量,所得GABA含量数值均以干基计。

1.2.2 植物乳杆菌的活化及菌悬液的配制 将实验室保存的植物乳杆菌菌种接种至灭菌处理过的MRS肉汤培养基中,于37℃恒温培养12h后,培养基下方出现明显的菌层。摇匀成菌悬液,在无菌操作台上进行菌种的稀释计数,稀释倍数为10-8,根据平板计数法,得到稀释后菌悬液的活菌数为4.9×109cfu/mL。将此菌悬液于0℃下贮存,用于接种糙米[12]。

1.2.3 发酵糙米米粉的制作工艺 将糙米用无菌水冲洗两次,去掉谷壳屑等杂质,取40g糙米于灭菌后的三角瓶,加40mL无菌水后进行接种密封。将处理后的试样于一定温度下培养一段时间后进行米粉的制作。

米粉制作简要工艺[13]:取样→打浆→摊浆→蒸煮→回生成型→烘干。其中,磨浆糙米及浆液直接取自发酵样;蒸煮成型时间控制在40～60s内,将成型后的糙米米粉于室温条件下老化后进行切片晾干。

1.2.4 单因素实验 考察植物乳杆菌接种糙米进行发酵的单因素指标为发酵温度、发酵时间、接种量。固定发酵时间24h,接种量2%,发酵温度分别为25、30、35、40、45℃;固定发酵温度40℃,接种量2%,发酵时间分别为0、12、24、36、48、60h;固定发酵温度40℃,发酵时间24h,接种量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%。以GABA的含量为单因素考察指标。

1.2.5 响应面分析实验 综合单因素实验结果,确定了发酵温度、发酵时间、接种量三个因素的三个水平,根据Box-Behnken实验设计原理,采用响应面分析方法,因素水平设计表见表1。

表1 响应面实验设计因素及水平Table1 Code values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.6 数据处理 采用Excel 2010和Design-Expert 8.0.5.0软件对响应面数据进行回归分析与方差分析。

1.2.7 发酵米粉的综合评价 通过对比发酵米粉与未发酵米粉的GABA含量,蒸煮性质及口感来进行发酵米粉的综合评价。未发酵糙米米粉的制作方法,将糙米浸泡12h后按1.2.3的工艺进行。

蒸煮性质通过比较两种米粉蒸煮难易程度、断条情况来评价,口感通过比较两种米粉入口细腻程度及口味来评价。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果及分析

2.1.1 发酵时间对GABA含量的影响 从图1可以看出,发酵糙米中的GABA含量随着发酵时间的延长而增加,0～24h内GABA含量增加明显，发酵时间超过48h后，GABA的含量变化则逐渐趋于平缓。可能原因是，0～24h是植物乳杆菌的生长及生理活跃时期，此条件下糙米中的蛋白质被大量分解利用，使发酵样中GABA含量呈快速增长趋势，而发酵48h后,谷氨酸脱羧酶与底物的反应已经达到了饱和程度,继续反应GABA的含量也不会增加,还可能会被其他微生物利用。

图1 发酵时间对GABA含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the content of GABA

2.1.2 接种量对GABA含量的影响 从图2可以看出,发酵时间一定的情况下GABA的含量随着接种量的增加呈现先增加后减少的趋势,在接种量为2%的条件下,含量达到最大。说明了接种量为2%时,发酵样既可以维持乳杆菌的正常生理功能又能为生成GABA的酶促反应提供足够的底物;当接种量超过2%时,发酵样中的能源物质在满足乳杆菌的生长后,已不足以满足酶促反应,导致了GABA的含量有所降低。

图2 接种量对GABA含量的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on the content of GABA

2.1.3 发酵温度对GABA含量的影响 从图3可以看出,GABA的含量随着发酵温度的升高呈先增加后降低的趋势,在40℃时含量达到最大值。说明了植物乳杆菌的最适温度在40℃附近,在最适温度的生长条件下乳杆菌的各项生理功能指标达到最佳,所产生的酶也达到最多,故生成的GABA含量最多。

表3 回归模型方差分析结果Table3 Analysis of variance for the proposed regression model

图3 发酵温度对GABA含量的影响Fig.3 Effect of culture temperature on the content of GABA

注:*差异显著(p<0.05);**差异极显著(p<0.01)。

2.2 响应面实验

响应面组实验结果见表2。通过Design-Expert 8.0.5.0对数据结果进行回归拟合后,得到的GABA的含量对发酵时间A、接种量B、发酵温度C的二次多项式回归方程为Y=3.12+0.15A-0.067B+0.039C+1.0×10-2AB-7.5×10-3AC+0.015BC-0.19A2-0.13B2-0.063C2。

表2 Box-Benhnken实验设计及结果Table2 Box-Benhnken experimental design arrangement and correspongding results

表3显示了回归模型方差分析的结果。模型呈极显著(p<0.0001),失拟项不显著,R2=0.9988,说明了该模型与实际实验拟合度好,在一定实验范围内能用于指标的预测以及进行参数对指标影响规律的分析。从模型中可以看出,发酵时间(A)、接种量(B)、发酵温度(C)对GABA含量的影响均为极显著,影响顺序为A>B>C;交互项中,BC交互作用显著,AB、AC交互作用不显著,说明了接种量和培养温度对发酵样中GABA含量的影响显著,即足够的植物乳杆菌在适宜的生长温度下能明显地提高GABA的含量。

2.3 响应面工艺优化分析

图4为Design Expert 8.0.5.0做出的两因素自变量对指标的3D响应曲面,由图可以直观地反映每个因素对响应值的影响及两两交互作用。发酵温度固定为最佳值40℃时(图4a),GABA的含量随着接种量的增大呈先增后减的趋势、随发酵时间的延长也成先增后减的趋势,接种量的最佳水平范围为1.55%～2.20%,发酵时间的最佳水平范围为46～59h;接种量固定为最佳值2%时(图4b),两个因素对GABA含量的影响同为先增后减趋势,在实验范围内发酵温度的最佳水平范围为37.5～45℃,接种量的最佳水平范围为1.6%～2.16%;发酵时间固定为最佳水平48h时(图4c),两个因素对GABA含量的影响同为先增后减趋势,发酵时间的最佳水平范围为46～59h,发酵温度在实验范围内的最佳水平范围为36.5～46.1℃。

图4 两因素对GABA含量影响的响应曲面与等高线Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the content of GABA注:a：固定发酵温度40℃;b：固定接种量2%;c：固定发酵时间48h。

通过响应面的优化分析,各因素的最佳水平为发酵时间52.57h,接种量1.89%,发酵温度41.28℃,GABA含量的预测值为3.165mg/g。为操作方便,将最佳条件设置为发酵时间52h,接种量2%,发酵温度40℃,此条件下进行平行验证实验,GABA平均含量为3.14mg/g,与预测值的相对误差约为0.8%。

2.4 发酵米粉的综合评价

将最优条件下的发酵样加工成米粉,于40℃下烘干,测定干样中的GABA含量为2.92mg/g,米粉加工过程GABA的损失率为7%;按同样的方法测定未接种植物乳杆菌的非发酵糙米米粉中的GABA,含量为0.87mg/g。则发酵过的糙米米粉中GABA含量是未发酵过的3.36倍。

米粉的蒸煮性上,最优条件下的发酵米粉比未发酵的米粉更易熟且不易断条;口感上,发酵米粉口感要更细腻且有一定的发酵风味,口味无明显酸味。

3 结论

通过响应面分析法对发酵糙米米粉发酵工艺的优化,以糙米中的GABA含量为响应指标,糙米米粉的最佳发酵工艺为发酵时间52h、接种量2%、发酵温度40℃;此条件下的GABA实际测定值为3.14mg/g,与理论含量3.165mg/g的相对误差为0.8%。综合方差分析的评价,可见响应面优化糙米米粉的发酵工艺参数可靠。

通过比较两种米粉的GABA含量、蒸煮性质及口感,发现发酵米粉较未发酵米粉有很大的改善。因此,无论在营养成分还是在口感上,发酵米粉都有广阔的发展空间。

[1]张珺,吴卫国,何义雁,等.糙米中植物活性物质的研究进展[J].粮食与饲料工业，2014(5):1-4.

[2]郑艺梅.发芽糙米营养特性,γ-氨基丁酸富集及生理功效的研究[D].武汉:华中农业大学,2006.

[3]闵伟红.乳酸菌发酵改善米粉食用品质机理的研究[J].食品与发酵工业,2003(6)：5-9.

[4]Lea B,Kim J,Kang Y M,et al. Antioxidant activity and r-aminobutyric acid(GABA)content in sea tangle fermented by Lactobacillus brevis BJ20 isolated from traditional fermented foods[J]. Food Chemistry,2010,122:271-276.

[5]Kim J Y,Lee M Y,Ji G E,et al. Production of γ-aminobutyric acid in black raspberry juice during fermentation by Lactobacillus brevis GABA100[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,130(1):12-16.

[6]Aoki H,Furuya Y,Endo Y,et al. Effect of γ-aminobutyric acid-enriched tempeh-like fermented soybean(GABA-tempeh)on the blood pressure of spontaneously hypertensive rats[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2003,67(8):1806-1808.

[7]Jakobs C,Jaeken J,Gibson K M. Inherited disorders of GABA metabolism[J]. Journal of Inherited Metabolic Disease,1993,16(4):704-715.

[8]Wong T,Guin C,Bottiglieri T,et al. GABA,γ-hydroxybutyric acid,and neurological disease[J]. Annals of Neurology,2003,54(S6):S3-S12.

[9]Seeram N P,Adams L S,Zhang Y,et al. Blackberry,black raspberry,blueberry,cranberry,red raspberry,and strawberryextracts inhibit growth and stimulate apoptosis of human cancer cellsinvitro[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(25):9329-9339.

[10]Shelp B J,Bown A W,McLean M D. Metabolism and functions of gamma-aminobutyric acid[J]. Trends in Plant Science,1999,4(11):446-452.

[11]陈恩成,张名位,彭超英,等.比色法快速测定糙米中γ-氨基丁酸含量研究[J].中国粮油学报,2006,21(1):125-128.

[12]周显青,陶华堂,王学锋,等.植物乳杆菌大米发酵条件的优化[J].河南工业大学学报:自然科学版,2013,34(6):1-7.

[13]杨大庆,魏尚洲.糙米米粉的加工[J].农产品加工,2004(5):29-30.

Process of fermentation brown rice noodle rich in γ-aminobutyric

ZHANG Jun,HE Yi-yan,ZHU Xiang-yan,WU Wei-guo*

(Food Science and Technology College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

The objective of this study was to optimize the process of brown rice noodle fermented by Lactobacillus. Single-factor and orthogonal experiments was based on three process parameters including fermentation time,inoculation amount and culture temperature. The content of γ-aminobutyric acid was response value. The three process conditions were optimized by response surface analysis based on a three-variable,three-level Box-Behnken experimental design. The optimized fermentation parameters were as follows:fermentation time 52h,inoculation amount 2%,culture temperature 40℃. Under this condition the content of γ-aminobutyric acid was 3.14mg/g,which showed a relative error of 0.8% when compared with the predictive value. After threatment of forming the content of γ-aminobutyric acid was 2.92mg/g.

response surface methodology;γ-aminobutyric acid;lactobacillus;brown rice noodle;fermentation

2014-09-16

张珺(1990-)，女，在读硕士，研究方向：食品科学。

*通讯作者:吴卫国(1968-)，男，博士，教授，研究方向：粮食加工工程。

2014年国家粮食公益性科研专项。

TS213.3

B

:1002-0306(2015)09-0239-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.043