补体C3a促进人视网膜色素上皮细胞分泌血管内皮生长因子的研究

阳雪，曹晓光，龙琴

（1.中国医学科学院北京协和医院眼科，北京 100073；2.北京大学人民医院眼科，北京 100044）

补体C3a促进人视网膜色素上皮细胞分泌血管内皮生长因子的研究

阳雪1，曹晓光2，龙琴1

（1.中国医学科学院北京协和医院眼科，北京 100073；2.北京大学人民医院眼科，北京 100044）

目的观察补体活化产物C3a对体外培养的人视网膜色素上皮细胞（RPE）分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）和半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法，测定浓度0.1 μmol/L和0.3 μmol/L的重组人C3a干预RPE细胞24、48、72 h后VEGF蛋白和mRNA表达水平。结果0.1 μmol/L的C3a干预RPE细胞72 h后，VEGF蛋白表达高于干预48 h和24 h的水平，差异均有统计学意义（P＜0.05）；0.3 μmol/L的C3a作用RPE细胞24、48、72 h后，VEGF蛋白表达组间差异均有统计学意义（P＜0.01），具有正性时间—效应关系；0.1 μmol/L的C3a作用RPE细胞72 h后，VEGF mRNA表达高于48 h和24 h，差异有统计学意义（P＜0.05）；0.3 μmol/L的C3a作用RPE细胞72 h后，VEGF mRNA表达高于48 h和24 h，差异有统计学意义（P＜0.01）；0.3 μmol/L的C3a作用72 h时VEGF的蛋白表达量高于0.1 μmol/L的C3a，差异有统计学意义（P＜0.01）；0.3 μmol/L的C3a作用24 h时VEGF mRNA表达量高于0.1 μmol/L的C3a，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论C3a可促进人RPE细胞VEGF的分泌，高浓度C3a对VEGF分泌的促进作用早于低浓度C3a，提示补体活化程度越强，对新生血管的促进作用则越迅速。

人视网膜色素上皮细胞；补体C3a；血管内皮生长因子

近年来，补体在脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）发生过程中的作用受到越来越多的关注［1，2］。补体系统活化所产生的多种裂解片段，尤其是C3a，与靶细胞表面受体结合，释放炎性介质和细胞因子，成为补体依赖性反应的中心环节。研究表明，在年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）患者的玻璃膜疣和小鼠CNV模型局部均可见C3a表达显著升高［3，4］，抑制C3a或C3a受体功能则可减轻动物模型中CNV的发生［4］。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）作为CNV启动信号的产生者，可表达包括C3a在内的多种补体受体，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为机体内新生血管形成的强促进因子，在CNV的发生中起重要作用［5］，然而，C3a与VEGF的内在效应关系目前研究不足。因此，本研究拟通过观察C3a刺激人RPE细胞中VEGF分泌的变化，探讨C3a在CNV发生过程中可能存在的信号转导机制。

1 材料与方法

1.1 RPE细胞培养

人RPE细胞ARPE19细胞株由北京大学人民医院眼科实验室馈赠。RPE细胞培养参照文献［6］。将冻存的RPE细胞复苏后，置于37℃、5%CO2、湿度90%的培养箱中培养，采用含15%胎牛血清的DMEM+Ham′s F12培养基（F12）（1∶1）。当细胞接近融合时，用0.25%胰酶+0.02%EDTA进行传代。将生长良好的自复苏开始传代3次的RPE细胞计数后以4×105/孔的细胞密度接种于6孔培养板，培养48 h细胞达到70%融合后，用含2 mmol/mL谷氨酰胺的无血清培养基替换含血清培养基，培养24 h后弃去培养液进行干预实验。

1.2 C3a干预实验

采用重组人C3a（204881，Millipore公司，美国）进行RPE干预实验，培养基为无血清DMEM+F12培养基。实验组：RPE细胞培养液中加入含终浓度分别为0.1和0.3 μmol/L的C3a；对照组：RPE细胞培养基中不加C3a（终浓度为0 μmol/L）。培养24 h、48 h和72 h后，分别收集细胞上清液1 mL，置于-80℃保存待用，每种C3a浓度和时间点设4个平行孔。

1.3 RPE细胞分泌蛋白水平的检测

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法进行RPE细胞的VEGF蛋白分泌量检测。参照VEGF试剂盒（ExCell Biology Inc.公司，中国上海）说明书进行操作。将各孔数值与其相同时间下空白对照孔数值的比值代表蛋白表达进行统计分析。

1.4 RPE细胞分泌mRNA水平的检测

采用0.2 μmol/L C3a刺激RPE细胞48 h，以0 μmol/L C3a作为对照。收集各孔细胞，Trizol法提取细胞总RNA，进行逆转录聚合酶链式反应（RTPCR），2%琼脂糖凝胶电泳，同时设立空白对照和GAPDH为内参照。应用凝胶图像处理系统进行条带灰度分析，VEGF和PEDF的灰度值与同一样品GAPDH的灰度值的比值代表其mRNA的表达参与统计分析。VEGF上游引物：5′TGCATTCACATTTG TTGTGCTGTAG 3′，下游引物5′GCAGATTATGCGG ATCAAACC 3′；GAPDH上游引物：5′TCACCATCT TCCAGGAGCGAG 3′，下游引物：5′TGTCGCTGTTG AAGTCAGAG 3′。

1.5 统计学分析

采用SPSS 11.5和GraphPad Prism 5软件进行统计分析，总体差异比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。本研究测量指标的数据资料以表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C3a作用下RPE细胞刺激VEGF分泌的时间—效应关系

2.1.1 VEGF蛋白水平：浓度为0.1 μmol/L的C3a分别作用24 h、48 h、72 h后，各个时间点RPE细胞VEGF蛋白表达的差异有统计学意义（F=6.56，P＜0.05），经组间比较发现，作用48 h与24 h VEGF蛋白表达无统计学差异（q=1.69，P＞0.05），作用72 h后VEGF蛋白表达分别是48 h和24 h的1.13倍和1.22倍，差异均有统计学意义（72 h vs 48 h：q= 3.34，P＜0.05；72 h vs 24 h：q=5.03，P＜0.01）。浓度为0.3 μmol/L的C3a分别作用24 h、48 h、72 h后，各个时间点RPE细胞VEGF蛋白表达的差异有统计学意义（F=86.20，P＜0.01），经组间比较发现，作用24 h、48 h、72 h VEGF蛋白表达组间差异均有统计学意义（24 h vs 48 h：q=9.38，P＜0.01；24 h vs 72 h：q=18.57，P＜0.01；48 h vs 72 h：q=9.19，P＜0.01），作用72 h后VEGF蛋白表达分别是48 h和24 h的1.72倍和1.26倍。见表1，图1。

2.1.2 VEGF核酸水平（RT-PCR）：浓度为0.1 μmol/L的C3a分别作用24 h、48 h、72 h后，各个时间点VEGF mRNA表达的差异有统计学意义（F=10.89，P＜0.01），经组间比较发现，作用48 h与24 h后VEGF mRNA表达无统计学差异（q=2.34，P＞0.05），作用72 h后VEGF mRNA表达分别是48 h和24 h的1.13倍和1.22倍，差异有统计学意义（72 h vs 48 h：q=4.17，P＜0.05；72 h vs 24 h：q=6.51，P＜0.01）。浓度为0.3 μmol/L的C3a分别作用24 h、48 h、72 h后，各个时间点RPE细胞VEGF mRNA表达的差异有统计学意义（F=18.49，P＜0.01），经组间比较发现，48 h与24 h VEGF mRNA表达无统计学差异（q=0.40，P＞0.05），作用72 h后VEGF mRNA表达分别是48 h和24 h的1.23倍和1.25倍，差异有统计学意义（72 h vs 48 h：q=7.24，P＜0.01；72 h vs 24h：q=7.64，P＜0.01）。见表2，图2。

表1 不同浓度C3a作用下VEGF蛋白表达水平Tab.1 Protein level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

图1 C3a作用下RPE细胞分泌VEGF蛋白水平Fig.1 Protein level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

2.2 C3a干预RPE细胞分泌VEGF的剂量-效应关系

ELISA结果显示：0.1 μmol/L与0.3 μmol/L的C3a作用24 h、48 h后，VEGF的蛋白表达水平无统计学差异（24 h：t=2.28，P＞0.05；48 h：t=1.59，P＞0.05），而0.3 μmol/L的C3a作用72 h后VEGF蛋白表达水平是0.1 μmol/L C3a作用下蛋白表达的1.20倍，差异有统计学意义（t=10.57，P＜0.01）。RTPCR结果显示：0.3 μmol/L C3a作用24 h后，VEGF mRNA表达水平是0.1 μmol/L C3a作用下的1.08倍，差异有统计学意义（t=1.19，P＜0.01），而0.1 μmol/L与0.3 μmol/L C3a作用48 h和72 h后VEGF mRNA表达水平无统计学差异（48 h：t=0.48，P＞0.05；72 h：t=7.42，P＞0.05）。

表2 不同浓度C3a作用下VEGF mRNA表达水平Tab.2 mRNA level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

图2 C3a作用下RPE细胞分泌VEGF mRNA水平Fig.2 mRNA level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

3 讨论

CNV是眼内新生血管的重要表现形式之一，常累及黄斑，造成出血、渗出和瘢痕形成，严重影响视功能，因此成为包括AMD、病理性近视、息肉样脉络膜血管病变等眼部疾病的主要致盲原因［7～9］。CNV形成的确切机制目前尚不清楚，其病理生理变化包括细胞外基质降解、血管内皮细胞增生和毛细血管管腔形成等过程，RPE细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞以及VEGF等促血管生长因子和色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等抑血管生长因子共同参与和调控CNV的发生发展［10］。临床研究和动物实验显示，眼内拮抗VEGF可有效地减轻CNV的发生［11，12］。CNV的发生原因除缺氧因素外，组织学研究证实，在CNV膜上及其周围存在着补体成分表达升高，补体系统活化的中间产物C3和VEGF的变化具有相同的趋势［13］。因此，补体系统的活化成为CNV发生发展的另一病理生理基础。C3a作为补体系统活化过程中最重要的补体成分之一，对CNV形成必然起到不可忽视的作用。

本研究结果提示，一定浓度C3a干预可增加RPE细胞VEGF蛋白的分泌，向有利于新生血管生长的方向变化，与相关研究报道呈现相似的趋势［4］。从时间-效应关系分析，在相同浓度C3a刺激下，增加刺激时间可增加VEGF的蛋白分泌，其中低浓度C3a（0.1 μmol/L）需要刺激RPE细胞72 h后VEGF的升高才可达到统计学意义，而高浓度C3a（0.3 μmol/L）刺激48 h后VEGF即可显著升高，提示以C3a为标志的补体活化程度越强，对新生血管生成因子VEGF的促进作用则越迅速；从剂量-效应关系分析，在相同刺激时间下，增加C3a浓度后，VEGF的蛋白分泌具有升高的趋势。mRNA水平的检测结果显示了同样的变化，进一步提示补体活化对RPE细胞所参与的新生血管生成的促进作用。然而，本研究结果还发现，蛋白水平的变化和mRNA水平的变化并不完全同步，0.3 μmol/L C3a作用24 h后，VEGF mRNA表达水平显著增加，但并不伴有VEGF蛋白水平的增加，其原因可能与VEGF mRNA的转录后翻译延迟，或其他细胞因子（如PEDF）和转化生长因子（transforming growth factor β，TGF-β）等的相互作用有关。

此外，本研究结果发现，在无C3a作用下，RPE细胞本身可分泌一定量的VEGF（数据未显示），这一生理现象同样出现在既往和相关研究中［5，6］。VEGF的基础分泌不仅对于维持脉络膜的营养具有重要意义，同时，以VEGF为代表的促血管生成因子和PEDF等抑血管生成因子的平衡参与并维持了新生血管形成的生理性调控作用。假设在缺氧或其他损伤作用下，补体系统活化后产生包括C3a在内的活性因子，通过改变促血管生长因子和抑血管生长因子的生理平衡状态，促进新生血管的生长，一方面启动机体的损伤修复反应，另一方面由于新生血管尚不完善的生理功能，出现早期的渗出、出血和晚期的瘢痕形成等病理反应。因此，如何合理调控损伤修复过程，增加新生血管的正常生理功能，抑制其病理过程，对新生血管性脉络膜视网膜病变的治疗具有重要的临床意义。

补体系统作为一个高度复杂的生物反应体系，由30余种蛋白分子所组成，它们相互作用并被体内存在的精细而复杂的机制所调控。C3a代表补体系统的活化状态，不仅影响着VEGF等细胞因子的分泌，而且对于和CNV形成密切相关的基质金属蛋白酶系统的功能同样起调控作用［14］。此外，上述细胞因子和蛋白酶通过影响其上游和下游物质，如结缔组织生长因子、TGF-β等，构成CNV形成的级联效应系统。本研究初步验证了C3a促进VEGF分泌的作用，进一步的研究将探讨C3a作用下血管内皮细胞的增生、迁移等变化，从而完善补体活化状态对新生血管管腔形成的影响，为临床CNV的靶分子治疗提供新的靶点和相应的理论依据。

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（编辑 王又冬）

C3a Stimulatesthe Secretion ofVEGF in Human Retinal Pigment Epithelial Cells

YANGXue1，CAOXiao-guang2，LONGQin1

（1.Department of Ophthalmology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China；2.Department of Ophthalmology，Peking University People′s Hospital，Beijing 100730，China）

Objective To investigate the effect of C3a on vascular endothelial growth factor（VEGF）secretion in cultured human retinal pigment epithelial cells（RPECs）.MethodsRPECs were cultured in the presence of C3a at different concentrations（0.1 μmol/L and 0.3 μmol/L）for 24 h，48 h and 72 h.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）and semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）were used to detect the protein and mRNA levels of VEGF.ResultsThe protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.1 μmol/L at the time of 72 h was higher than that of 48 h and 24 h（P＜0.05）.A positive correlation was indicated between the protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L and the duration of this influence（P＜0.01）.The mRNA expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.1 μmol/L and 0.3 μmol/L at the time of 72 h was higher than that of 48 h and 24 h（P＜0.05），respectively. The protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L was higher than that of 0.1 μmol/L at the time of 72 h（P＜0.01）.The mRNA expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L was higher than that of 0.1 μmol/L at the time of 24 h（P＜0.01）.ConclusionC3a promotes the secretion of VEGF in RPECs in a concentration dependent manner，which indicates that the stronger the activation of complement is，the faster the promotion of neovascularization.

human retinal pigment epithelium cell；C3a；vascular endothelial growth factor

R774.1

A

0258-4646（2015）11-0966-05

国家自然科学基金（81070755）

阳雪（1990-），女，硕士研究生.

龙琴，E-mail：longqinbj@hotmail.com

2015-09-16

网络出版时间：