经低强度超声波照射后组织工程骨成骨的组织学观察

王居勇，王居强，王华，沈惠良，刘争宇，张庆明，刘利民，穆虹

（1.首都医科大学宣武医院骨科，北京 100053；2.中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001；3.北京黎明医院妇产科，北京100011）

经低强度超声波照射后组织工程骨成骨的组织学观察

王居勇1，王居强2，王华3，沈惠良1，刘争宇1，张庆明1，刘利民1，穆虹1

（1.首都医科大学宣武医院骨科，北京 100053；2.中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001；3.北京黎明医院妇产科，北京100011）

目的观察低强度超声波照射后组织工程骨的骨形成情况和生物力学变化。方法将骨髓间充质细胞/β-磷酸三钙（BMSCs/β-TCP）共同增殖分化培养2周后，手术植入同基因鼠背部两侧皮下，一侧行超声波照射20 min/d，另一侧作为对照。术后5、10、25和50 d，分别取出组织工程骨，行HE染色和CD31免疫组化染色，观察组织学变化。结果组织学观察发现，超声波组组织工程骨较对照骨软组织修复、血运和血管形成更佳，骨形成更广泛。结论低强度超声波能够促进组织工程骨内的血运和骨形成。

磷酸三钙；低强度超声波；骨髓间充质细胞；骨形成

研究显示，组织工程骨内骨形成具有一定的局限性［1～3］。有学者采用低压细胞种植和流动性细胞培养方法提高细胞在多孔生物材料内的种植效率，以增强组织工程骨的骨形成［2，4，5］。另外，生物材料内血运建立的迟缓也可导致组织工程骨内部分细胞死亡，引起骨形成量减少和分布不均匀［2，6］。因此，手术将组织工程骨植入体内后，如何促进其骨形成非常重要。研究证实，低强度超声波能够促进骨折愈合，增强骨折的生物力学强度，促进骨折创伤部位炎症消除、骨折修复和再建［7～10］。本研究拟将骨髓间充质细胞/β-磷酸三钙（bone marrow stromal cells/β tricalcium phosphate，BMSCs/β-TCP）复合体植入鼠的皮下，然后进行超声波照射，通过生化学、生物力学和组织学方法观察组织工程骨的骨形成情况和生物力学变化。

1 材料与方法

1.1 材料

多孔生物材料：β-TCP由日本Olympus公司无偿提供。5 mm×5 mm×5 mm立方体形状，多孔率75%，孔尺寸200～400 μm，孔与孔之间的连接通道直径100～200 μm。

实验动物：7周龄Fischer-344鼠，雄性，24只，由日本东京医科齿科大学骨科提供。

低强度超声波（SAFHS；Smith&Nephew，Memphis，TN，美国）：强度30 mW/cm2，频率1.5 MHz，超声波探头直径25 mm。

主要试剂：蛋白酶、鼠抗人CD31单克隆抗体、猪抗鼠/兔/羊的免疫球蛋白G均购自丹麦DakoCytomation公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离和扩增：动物骨髓来源于7周龄雄性Fischer-344鼠的股骨。采用Wang等［2］的方法进行骨髓间充质细胞提取、培养及与多孔β-TCP的二次培养分化。二次分化培养细胞2周后，植入鼠背部皮下。

1.2.2 移植手术方法：腹腔内注射苯巴比妥（3.5 mg/100 g）麻醉后，于鼠背部中线做切口，向左右两侧分离皮下至2.5 cm处，并各植入1个组织工程骨，缝合切口。

1.2.3 低强度超声波照射：给予Fischer-344鼠背部右侧组织工程骨（超声波组）超声波照射20 min/d；左侧作为对照组，不给予任何处置。照射后5、10、25和50 d时，分别处死每组动物各6只，取出组织工程骨标本（图1）。

图1 低强度超声波动物模型Fig.1 Animal model of the low⁃intensity pulsed ultrasound（LIPUS）treatment

1.2.4 组织学和免疫组织化学观察：收获BMSCs/β-TCP标本后，立即行10%中性甲醛固定、K-CX溶液脱钙和石蜡包埋。制5 μm厚切片，HE染色，行组织学观察。将脱钙切片依次经0.4 mg/mL蛋白酶K、3%过氧化氢溶液和5%脱脂乳处理，滴加鼠抗人CD31单克隆抗体（1∶100稀释），4℃过夜，与猪抗鼠/兔/羊的免疫球蛋白G作用10 min。

2 结果

照射5 d后，肉眼可见超声波组组织工程骨周围软组织紧密结合，颜色鲜红，显示血运较好，镜下见组织工程骨孔隙内存在大量红细胞（图2C）；对照组工程骨周围鲜见软组织附着，周围组织色泽暗淡（图2A），骨孔隙内很少有细胞存在（图2B）。

图2 低强度超声波照射5 d后组织学观察Fig.2 The histomorphology images of the implanted porous composites treated by LIPUS for 5 days

照射10 d后，CD31免疫组化染色结果显示：对照组组织工程骨孔隙内很少见到血管内皮细胞（图3A），而超声波组孔隙内可见大量血管内皮细胞，周围伴随纤维组织（图3B）。

图3 超声波照射10 d后组织学观察 CD31染色×100Fig.3 Representative histological sections of the composites treated by LIPUS for 10 days，stained with immunohistochemistry for the anti⁃CD31 antibody×100

超声波照射25 d后，与对照组（图4A）比较，超声波组组织工程骨孔隙内可见大量的骨形成，分布于β-TCP空隙边缘，骨组织逐渐向孔隙深部生长（图4B）；孔隙内形成的骨组织表面可见成骨细胞呈链状排列分布，显示骨形成活跃；同时可见大量的小血管分布于骨形成周围。

超声波照射50 d后，对照组（图4C）和超声波组（图4D）组织工程骨孔隙内都可见大量骨形成。β-TCP孔隙内排列的骨组织更多，新生的骨组织周围可见类骨髓样组织，超声波组这种组织学改变更加明显。25 d和50 d这2个时点的骨组织形成几乎都是纤维组织骨，未观察到板层骨组织。

图4 超声波照射25 d和50 d组织学观察结果 HE×100Fig.4 Sections of implants for 25 and 50 days in the LIPUS group and control group HE×100

3 讨论

在临床实践中，经常需要使用较大的替代骨组织的生物材料。然而，即使在多孔生物材料内均匀地种植了骨细胞，组织工程骨内骨形成也是很局限的，这是由于组织工程骨移植后，内部血运建立迟缓，导致骨细胞死亡［6］。目前，多数骨组织工程研究仍是在体外进行；组织工程骨移植入体内后，对于如何促进体内的骨形成，还没有更好的办法。

研究证实，超声波能够促进骨折愈合，增强骨的抗应力变化。低强度超声波能够促进组织血管、软骨和骨形成，在促进骨愈合方面明显优于其他强度超声波［9～12］。目前，关于低强度超声波照射BMSCs的大量研究都是在体外进行的，超声波照射移植术后组织工程骨的体内研究还很少。Hui等［13］在猴子脊柱后外侧融合手术中植入带BMSCs的多孔生物材料，然后进行超声波照射，发现脊柱后外侧形成很好的骨融合，但这个骨形成是术中横突部位去皮质化后横突本身的骨细胞长入还是BMSCs的骨形成，却不能明确。本研究将BMSCs/β-TCP移植到动物皮下，排除了其他骨细胞作用的干扰，并在移植手术后给予超声波照射，观察到了组织工程骨内大量的骨组织形成。

本研究通过观察多孔材料β-TCP内骨形成情况，证实了低强度超声波对组织工程骨骨形成的影响。本研究结果显示：超声波照射5 d后，对照组周围组织颜色暗淡且尚未与组织工程骨形成附着，镜下观察孔隙内很少见到细胞和纤维组织，而超声波组生物材料孔隙内可见大量红细胞存在。提示低强度超声波能够促进组织工程骨骨形成，促进生物材料内早期血管形成和血液流动，从而增加组织工程骨内骨细胞的营养供应，加快排除机体代谢废物。与Rawool等［14］的研究结果一致。

研究认为超声波能够促进血管内皮生长因子的高度表达和新生血管形成，并提出了超声波介导的微泡破坏机制（ultrasound-mediated microbubble technique，UMMT）［15，16］，即超声波能够产生声波空洞化，破坏血管内皮细胞，进一步促使新生血管形成［15，17，18］。尽管本研究中使用的超声波强度与之不同，但是超声波照射5 d和10 d后的组织学表现与其相似。超声波照射引起的组织工程骨内和周围的早期血管形成增强了局部血液循环，有利于BMSCs分化成成骨细胞，从而对组织工程骨内良好的骨形成发挥了重要作用。

综上所述，本研究结果显示，在组织工程骨移植手术后，用低强度超声波照射体内生物材料部位可以促进骨形成。因此，在组织工程骨移植术后的恢复阶段，低强度超声波是一种既方便又有效的治疗手段。

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（编辑 王又冬）

HistologicalObservation ofBone Formation in Tissue Engineering Bone after Low-intensity Pulsed Ultrasonic Irradiation

WANG Ju-yong1，WANG Ju-qiang2，WANG Hua3，SHEN Hui-liang1，LIU Zheng-yu1，ZHANG Qing-ming1，LIU Li-min1，MUHong1

（1.Department of Orthopedic Surgery，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China；2.Department of Orthopaedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Obsterics and Gynecology，Beijing Liming Hospital，Beijing100011，China）

Objective To promote extensive bone formation in the composites of porous ceramics and bone marrow stromal cells（BMSCs）by lowintensity pulsed ultrasound（LIPUS）.MethodsBMSCs/βtricalcium phosphate（β-TCP）composites were sub-cultured for2 weeks and then subcutaneously implanted into syngeneic rats，and then the rats were randomly divided into LIPUS treatment group and control group.These implants were harvested at 5，10，25 and 50 days after implantation.The samples were then stained with hematoxylin and eosin（HE）and observed by light microscopy.ResultsHistomorphometric analysis revealed a great degree of soft tissue repair，increased blood flow，better angiogenesis，and increased bone formation in the LIPUS group compare to the controls.ConclusionLIPUS treatmentappearsto enhance bone formation and angiogenesisin the BMSCs/tricalcium phosphate composites.

tricalcium phosphate；low-intensity pulsed ultrasound；bone marrow stromal cells；bone formation

R687.3+4

A

0258-4646（2015）11-0970-05

国家自然科学基金（31040029）；北京自然科学基金（3112012）

王居勇（1967-），男，副教授，博士.

E-mail：wangjywh1@sina.com

2015-04-03

网络出版时间：