瘦素缺陷型ob/ob小鼠和C57BL/6J小鼠生物学特性的对比研究

薛欣，李玉梅，陈冰，张立石，马雅銮，汪旭

（1.中国中医科学院中医基础理论研究所实验中心，北京 100700；2.中国医科大学附属第一医院内镜诊疗科，沈阳 110001）

瘦素缺陷型ob/ob小鼠和C57BL/6J小鼠生物学特性的对比研究

薛欣1，李玉梅1，陈冰1，张立石1，马雅銮1，汪旭2

（1.中国中医科学院中医基础理论研究所实验中心，北京 100700；2.中国医科大学附属第一医院内镜诊疗科，沈阳 110001）

目的对比瘦素基因遗传缺陷ob/ob小鼠与C57BL/6J野生型小鼠的生物学特征，为进一步的中药研究提供可靠的脂肪肝动物模型。方法将8周龄、雌性C57BL/6J野生型及ob/ob小鼠分别作为对照组和模型组，标准饲料喂养至16周。每周测量1次体质量和体温；检测血清肝功能（天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶）和血脂（总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）含量；检测肝质量、肝组织中总胆固醇、甘油三酯含量，并进行肝组织HE染色。结果与C57BL/6J野生型小鼠比较，ob/ob小鼠体质量显著增加（P＜0.000 1）；肛温明显降低（P＜0.001）；血脂总胆固醇、高密度脂蛋白、肝重、肝脏指数、肝功能、肝组织中总胆固醇、甘油三酯含量明显增高（P均＜0.01）。大体及组织病理结果显示，16周ob/ob小鼠肝脏表现为中、重度脂肪肝的病理特征。结论ob/ob小鼠是较好的非酒精性脂肪性肝病动物模型，具有发病快、稳定、显著、重复性高等特点。

ob/ob小鼠；非酒精性脂肪性肝病；生物学特性；瘦素基因遗传缺陷

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已经成为危害人类健康的常见慢性肝病之一，在我国NAFLD患病率有逐年上升的趋势［1］。NAFLD与代谢综合征、2型糖尿病、心脑血管等疾病的发病密切相关，合适的脂肪肝动物模型在NAFLD的发病机制研究、预防、治疗及药物开发过程中发挥极其重要的作用。目前应用的脂肪肝动物模型以大鼠高脂模型为主，但其造模时间长、成本高。瘦素基因遗传缺陷ob/ob小鼠是用于研究人类NAFLD的动物模型之一。本研究通过对瘦素基因遗传缺陷ob/ob小鼠与C57BL/6J野生型小鼠的部分生物学特征、生理生化指标进行对比研究，为该小鼠在NAFLD研究中的应用提供参考及基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：瘦素基因遗传缺陷ob/ob小鼠及野生型C57BL/6J小鼠各10只，8周龄，雌性，购自南京鹏晟生物科技发展有限公司［SCXK（苏）2009-0001］；在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物室喂养，实验动物室许可证号SYXK（京）2005-0024。动物室温度20～25℃，湿度65%～75%，通风良好。2组小鼠均以标准饲料喂养、自由饮水。1.1.2 主要试剂：总胆固醇测定试剂盒（COD-PAP法）、甘油三酯测定试剂盒（GPO-PAP法）购自中生北控生物科技股份有限公司，批号分别是201301131491、201301135901。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模：分为2组，C57BL/6J野生型小鼠为对照组，瘦素基因遗传缺陷ob/ob小鼠为模型组。2组小鼠从8周标准饲料喂养至16周。

1.2.2 生存状态观测：每周测体质量、肛温，并观察小鼠外观、行为、饮食、粪便、毛发及死亡情况等一般指标。

1.2.3 生化检测：第16周时将小鼠禁食不禁水12 h，小鼠摘眼球取血、分离血清。血清天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的含量在首都医科大学临床检测中心用全自动生化分析仪（日本Olympus 2700）检测，测定方法按试剂盒说明书进行。

1.2.4 肝脏相关指标检测：（1）处死小鼠并剖开腹腔，肉眼观察肝脏的形态、大小、色泽等。（2）分离肝组织，生理盐水冲洗、吸干后称取肝湿重，计算肝脏指数，肝脏指数（%）=肝湿重/体质量×100。（3）肝组织TC、TG含量检测：取50 mg肝组织，加入2 mL氯仿/甲醇（体积比为2∶1）进行肝组织匀浆，将肝组织匀浆液封闭、置于旋转式摇床过夜；加入2 mL 0.6%氯化钠溶液，振荡混匀，3 000 r/min离心10 min，取下层有机相，置于45℃金属浴上，并用氮气吹干后再溶于500 μL异丙醇中，振荡混匀。肝组织TC或TG含量的测定参照试剂盒操作说明。（4）肝组织病理HE染色：取肝组织，浸泡于4%多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋、切片，行苏木素－伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，光镜下观察小鼠肝脏病变。判断标准参见中华肝病学会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》（2010年修订版）［2］。

1.3 统计学分析

所有数据均使用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，计量资料用表示，组间比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态观察

ob/ob小鼠与同周龄的野生型小鼠相比，体形明显胖大、活动减少、排尿量增多，排便量无明显差别。2组小鼠皮毛均乌黑亮泽，五官无异常分泌物，皮肤、呼吸均正常。

2.2 体质量、肛温、肝重、肝脏指数的比较

与野生型小鼠比较，ob/ob小鼠体质量显著增加（P＜0.000 1），增高约2.3倍，肝重、肝脏指数亦明显增加（均P＜0.000 1），肛温较明显降低（P＜0.001），见表1。

表1 2组小鼠生理、生化指标的比较Tab.1 Comparison of physiological and biochemical indexes of WT and ob/ob mice

2.3 肝脂、肝功能的比较

与野生型小鼠比较，ob/ob小鼠肝组织中TC、TG含量明显增高（均P＜0.01），血清中AST、ALT含量亦显著增加（均P＜0.001）。说明ob/ob小鼠肝组织脂肪堆积的同时，肝细胞受损明显。见表1。

2.4 血脂（TC、TG、HDL、LDL）的比较

与野生型小鼠比较，ob/ob小鼠血清中TC、HDL（均P＜0.000 1）明显增高，TG、LDL略有升高，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

2.5 肝脏病理形态学的比较

肉眼观察，野生型小鼠肝脏外观呈红褐色，表面光滑，边缘锐利，质软有弹性；ob/ob小鼠肝脏呈棕黄色、肿大包膜稍紧、边缘圆钝，切面有油腻感（图1）。光镜下，野生型小鼠肝小叶结构正常，以中央静脉为中心细胞索排列整齐，肝窦正常，肝细胞结构清晰、胞质丰富、核圆位于中央。ob/ob小鼠肝小叶难辨认，肝索紊乱，肝细胞肿胀、胞质疏松、核被挤向边缘，胞质内有大小不等的空泡，以小泡性为主；汇管区和中央静脉周围出现明显炎性细胞浸润，并可见肝细胞坏死，脂变肝细胞占肝小叶的50%以上（图2）。

图1 2组小鼠肝脏肉眼观察Fig.1 Liver gross pathology of wild⁃type and ob/ob mice

图2 2组小鼠肝组织脂肪变性HE染色 ×200Fig.2 HE staining of hepatic steatosis of wild⁃type and ob/ob mice×200

3 讨论

瘦素基因遗传缺陷的ob/ob小鼠是一种由于ob基因的纯合子自发隐性突变、无法表达和分泌，具有正常功能的瘦素，表现为明显肥胖、代谢减退和低体温等特点的遗传性小鼠［3］。瘦素是由肥胖（ob）基因编码、脂肪细胞分泌的蛋白质类激素，具有调节机体摄食和能量代谢的作用：（1）抑制食欲；（2）增加能量消耗，抑制脂肪合成、促进其分解；（3）通过调控胰岛素、甲状腺激素、皮质酮、生长激素的合成及分泌发挥调节作用［4］。另外，瘦素在免疫调节、创伤修复、生殖、神经内分泌和血管新生等方面起重要作用。研究发现ob/ob小鼠体质量明显增加，16周时可达到同周龄野生型小鼠的2.3倍。究其原因是由于ob/ob小鼠基因遗传性缺乏瘦素，对交感神经活性的兴奋作用减弱，能量消耗降低引起大量脂肪蓄积导致肥胖［5］。另外，ob/ob小鼠体温明显低于野生型小鼠，整体活动度下降、喜聚集，其体质量的增加可能亦与体温降低、活动度减少引起的基础代谢率降低有关。

有文献报道ob/ob小鼠可出现明显的脂肪肝，并且ob/ob小鼠的肝脏在受脂多糖、缺血－再灌注损伤和乙醇的毒性作用下，极易出现明显的脂肪性肝炎和急性死亡［6，7］。研究发现：16周时ob/ob小鼠肝重、肝脏指数（P＜0.000 1）、肝组织TC、TG含量（P＜0.01）、肝功能（AST、ALT）（P＜0.001）较野生型小鼠显著增加；大体及组织病理学结果显示：16周的ob/ ob小鼠肝脏出现显著病理变化，表现为中、重度脂肪肝的病理特征。另外，ob/ob小鼠的脂肪肝具有发病快、稳定、显著、重复性高等特点，是良好的NAFLD实验动物模型，为相关药品的研发及NAFLD发病机制的探讨提供背景资料和参考依据。

［1］Fan JG，Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China［J］.J Hepatol，2009，50（1）：204-210.

［2］范建高.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）［J］.中华肝脏病杂志，2010，18（3）：163-166.

［3］Zhang J，Wright W，Bernlohr DA，et al.Alterations of the classic pathway of complement in adipose tissue of obesity and insulin resistance［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292（5）：1433-1440.

［4］苏晓艳，方朝晖.瘦素及瘦素抵抗与肥胖、2型糖尿病的关系研究进展［J］.安徽医药，2009，13（1）：1-3.

［5］李宏睿，孙文夏，潘杰.瘦素功能研究进展［J］.中国动脉硬化杂志，2004，12（1）：108-112.

［6］Hookman P，Barkin JS.Metformin reverses fatty liver disease in obese leptin-deficient mice［J］.Nat Med，2000，6（8）：998-1003.

［7］Yang SQ，Lin HZ，Lane MD，et al.Obesity increases sensitivity to endotoxin liver injury：implications for the pathogenesis of steatohepatitis［J］.Proc Natl Acad Sci，1997，94（6）：2557-2562.

（编辑 陈 姜）

Comparative Study of Biological Characteristics between Leptin Defectob/ob Mice and C57BL/6J Wild-type Mice

XUE Xin1，LIYu-mei1，CHENBing1，ZHANG Li-shi1，MAYa-luan1，WANGXu2

（1.Experimental Center，Institute of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2.Department of Endoscopy，The First Hospital，China Medical University，Shenyang110001，China）

Objective To comparatively study the biological characteristics of leptin gene defect ob/ob mice and C57BL/6J wild-type mice，so as to provide a reliable fatty liver animal model in further study of traditional Chinese medicine.MethodsFemale C57BL/6Jwild-type and ob/ob mice at the age of8 weeks were selected as control and model animals.The mice were feed with standard dietfor16 weeks，the body weight and analtemperature of mice were determined every week，liver function and blood fat of serum were determined in the 16th week.The liver tissues were harvested for liver index，total cholesterol（TC），triglycerides（TG）content detection and HE staining.ResultsCompared with the wild-type mice，the body weight，liver weight，liver index，TC，HDL，AST，ALT of serum and TC，TG concentration of liver tissues of ob/ob mice were significantly increased（both P＜0.01），and anal temperature ofob/ob mice were decreased obviously（P＜0.001）.General and histopathology showed that16 weeksofob/ ob mice performed the pathological features of moderate and severe fatty liver.ConclusionThe ob/ob mice is proved to be a good animal model of nonalcoholic fatty liver disease，with the characteristics of fast，stable，significant and high repeatability.

ob/ob mice；nonalcoholic fatty liver disease；biological characteristics；leptin gene defect

R-332

A

0258-4646（2015）11-0983-04

中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目（YZ-1109）；辽宁省科学技术计划项目（2013010043-401）

薛欣（1971-），女，副研究员，博士.

汪旭，E-mail：wangxu_cmu@163.com

2015-05-07

网络出版时间：