紫杉醇长循环热敏脂质体对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用*

李美波，顾生玖，赵文鹏，朱开梅

(桂林医学院药学院，桂林 541004)

紫杉醇长循环热敏脂质体对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用*

李美波，顾生玖，赵文鹏，朱开梅

(桂林医学院药学院，桂林 541004)

目的 研究紫杉醇长循环热敏脂质体(PLTL)对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用。方法 建立小鼠Lewis肺癌模型，将40只荷瘤鼠随机分为5组，空白对照组、模型对照组、紫杉醇注射液(PTX)组、紫杉醇热敏脂质体(PTL)组和PLTL组，每组8只。空白对照组和模型对照组注射0.9%氯化钠溶液，PTX组、PTL组和PLTL组，每只小鼠给药总剂量为紫杉醇20 mg·kg-1，采用0.9%氯化钠溶液稀释，每次注射0.2 mL。除空白对照组外，其他组给药后5 min内立即将小鼠的肿瘤部位固定于(42±0.5)℃的恒温水浴中加热30 min。治疗期间观察移植瘤体生长情况，苏木精-伊红(HE)染色检测肿瘤组织的病理学形态改变，观察肿瘤细胞的形态学变化，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡率，考察PLTL联合局部热疗对小鼠肿瘤的抑瘤作用。结果 模型对照组、PTX组、PTL组和PLTL组抑瘤率分别为21.81%，48.87%，57.22%和78.87%，肿瘤细胞凋亡率分别为(20.4±4.2)%，(42.7±3.8)%，(54.6±2.9)%和(69.7±5.0)%，肿瘤组织切片HE染色发现，PLTL组肿瘤细胞凋亡与坏死数量明显增多。结论 PLTL与PTX，PTL比较，具有明显的热敏靶向性，与局部热疗相结合显著提高紫杉醇的治疗效果。

紫杉醇；脂质体，热敏，长循环；癌，肺

据世界卫生组织统计，全球范围内，肺癌的发病率与病死率均居第一位[1]，因此肺癌仍然是全世界面临的公共健康问题。《2012中国肿瘤登记年报》显示[2]，我国肺癌病死率居恶性肿瘤首位。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是从红豆杉属植物中分离得到的一种抗肿瘤药物，其对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌[3]等多种肿瘤有良好的治疗效果[2]，现已成为多种恶性肿瘤治疗的首选药。然而，由于紫杉醇不溶于水及多种药用溶媒，目前市售紫杉醇注射液均采用由聚氧乙基蓖麻油和无水乙醇组成的混合溶媒，而聚氧乙基蓖麻油对人体具有多种毒性并引发部分患者严重变态反应，因而使紫杉醇注射液的应用受到限制。脂质体是一种新型药物载体，它具有改善药物溶解性，延长药物半衰期，提高药物靶向性和降低药物毒副作用等优点[4]。为解决紫杉醇的溶解性和毒副作用问题，提高药物作用疗效，笔者将紫杉醇制备成长循环热敏脂质体，并将其作用于Lewis肺癌荷瘤小鼠，评价其体内的抗癌疗效。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specific pothogen free,SPF)级C57BL/6小鼠40只，雌性，体质量(19±2)g，由桂林医学院实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK(桂)2013-0001号。动物自由饮水、进食。

1.2 细胞株 Lewis肺癌细胞株购自于中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库。

1.3 试剂与仪器 紫杉醇(桂林晖昂生化药业公司，批号：JF20100304)；紫杉醇注射液(扬子江药业集团有限公司，批号：13012111)；紫杉醇长循环热敏脂质体(PLTL，由本实验室采用薄膜分散法制备，包封率约95%，粒径分布在80～133 nm)；紫杉醇热敏脂质体(PTL，由本实验室采用薄膜分散-过膜法制备，包封率约97%，粒径分布在84～127 nm)；胎牛血清(Hyclone，批号：NXA0544)；达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，Hyclone，批号：NYG0923)；Annexin V 凋亡试剂盒(eBioscience，批号：E09656-1649)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；FCM(Becton Dickinson，美国)；电子数显卡尺(北京量具刃具厂)；光学显微镜(日本OLYMPUS BX51)。

1.4 小鼠Lewis肺癌细胞株的培养 Lewis肺癌细胞株培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，37 ℃、5%二氧化碳孵箱中培养，细胞半贴壁生长，每2 d换培养液1次，3～4 d传代1次。

1.5 Lewis肺癌荷瘤肿瘤模型的建立 取对数生长期Lewis细胞，用0.25%胰酶溶液消化，用不含血清的培养液吹打细胞制成细胞悬液，并调整细胞浓度为1×107个·mL-1，于小鼠右后肢靠背部皮下注射细胞悬液，每只接种0.2 mL。

1.6 小鼠分组和给药方法与体内抑瘤实验 待小鼠肿瘤直径达到8 mm时(记为第0天)，选取瘤体积一致的荷瘤小鼠随机分为5组，每组8只，分别为空白对照组(注射0.9%氯化钠溶液)、模型对照组(注射0.9%氯化钠溶液+加热)、PTX组(注射紫杉醇注射液+加热)、PTL组(注射PTL+加热)和PLTL组(注射PLTL+加热)，给药总剂量20 mg·kg-1。给药前各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉，然后尾静脉注射给药，给药后5 min内，除空白对照组外，其他组立即将小鼠肿瘤部位固定于42 ℃水浴中加热20 min，每隔2 d治疗1次，共治疗3次。治疗期间每天观察小鼠生存状态、测量肿瘤的长短径，计算肿瘤的体积(V)，V=1/2长径×短径2(单位：mm3)，绘制肿瘤生长曲线。并于第9天处死小鼠，剥取肿瘤组织称定质量，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1-治疗组瘤质量/空白对照组瘤质量)×100%。

1.7 肿瘤组织苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色 第9天处死动物，取一部分新鲜的肿瘤组织，用4%多聚甲醛溶液固定，组织脱水，蜡块包埋，病理切片，经梯度乙醇脱蜡、染色、中性树胶封固，显微镜观察并采集图像。

1.8 组织流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡 第9天处死动物后取新鲜肿瘤组织，研磨，滤过，冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)1 000 r·min-1离心5 min，收集细胞，弃上清液，冷PBS洗涤细胞2次(1 000 r·min-1，5 min)。1×结合缓冲液悬浮细胞(1×106个·mL-1)，加入AnnexinV-FITC 5 μL，轻轻混匀后于2～8 ℃避光条件下孵育20 min，然后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 μL后轻轻混匀，于2～8 ℃避光条件下孵育5 min，1 h内流式细胞仪检测，进行细胞凋亡率分析。

2 结果

2.1 小鼠生存状态、肿瘤体积生长曲线以及抑瘤率结果 在小鼠尾源静脉给药的过程中，PLTL组和PTL组小鼠与注射0.9%氯化钠溶液小鼠一样，无不良反应，PTX组的小鼠出现精神状态差、萎靡不振、毛色晦暗、饮食活动明显减少、易激惹躁动等症状，且该组动物在给药后3～4 d内出现食欲不振及体质量减轻等不良反应。说明紫杉醇纳米脂质体剂型能明显降低紫杉醇毒副作用。各组小鼠的肿瘤生长曲线(图1)，经3次治疗后，除空白对照组外，其余各组肿瘤生长均受到不同程度抑制，PTX组肿瘤体积几乎保持不变，而PTL组及PLTL组肿瘤体积开始缓慢下降，与空白对照组比较，其他4组均显示肿瘤的生长受到抑制，但PLTL组抑瘤效果最佳。各组小鼠肿瘤体积、瘤质量及抑瘤率见表1，模型对照组、PTX组、PTL组和PLTL组均有较明显的抑瘤作用。PTL组的抑瘤率高于PTX组，但差异无统计学意义，而PLTL组抑瘤率明显高于其余4组，差异有统计学意义，可见PLTL结合热疗可显著提高紫杉醇抗肿瘤效果。

2.2 肿瘤组织形态学 结果见图2。5组肿瘤细胞保留肿瘤细胞特有的异型性，核大深染，核异型，核细胞质比例高；模型对照组及其他给物组图中见凋亡细胞，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂，凋亡小体形成；凋亡细胞周围可见淋巴细胞及单核巨噬细胞，数量表现为模型对照组、PTX组、PTL组及PLTL组依次增多，各组肿瘤均出现不同程度的细胞坏死现象，其中PLTL组肿瘤细胞广泛坏死，核碎裂溶解，细胞结构消失(图2E)，而PTL组可见部分肿瘤细胞核碎裂、固缩，细胞结构消失以及片状坏死灶(图2D)，PTX组可见灶性坏死灶(图2C)。

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05；与PTX组比较，*3P<0.05；与PTL组比较，*4P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05；compared with PTX group，*3P<0.05；compared with PTL group，*4P<0.05

2.3 细胞凋亡结果 应用FCM术对活体肿瘤组织进行细胞凋亡的检测，肿瘤细胞凋亡结果(图3)。空白对照组、模型对照组、PTX组、PTL组及PLTL组细胞凋亡率分别为(9.4±2.0)%，(20.4±4.2)%，(42.7±3.8)%，(54.6±2.9)%和(69.7±5.0)%，与空白对照组比较，均差异有统计学意义(F=732.793，P=0.000)，PTL组和PLTL组与PTX组比较也差异有统计学意义(P=0.000)，PTL组和PLTL组比较差异有统计学意义(P=0.000)，该结果同以上肿瘤质量和抑瘤率的结果一致。

3 讨论

热疗是肿瘤治疗中一种辅助疗法，主要是利用肿瘤细胞对高温较敏感，通过对机体局部加温而达到杀死肿瘤细胞的目的，肿瘤组织局部加热39～42 ℃可使肿瘤组织血管闭塞和出血[5]，因此局部区域高热也是一个有用的辅助治疗，可增加药物的运输和靶向药物的蓄积。本实验中模型对照组与空白对照组相比均表现出较好的抑瘤效果，肿瘤质量抑瘤率为21.8%，流式检测凋亡细胞结果为(20.4±4.2)%，与空白对照组比较，均差异有统计学意义，HE切片也显示凋亡细胞与点状坏死灶增多。

热敏脂质体联合局部热疗可明显增强化疗药的抗肿瘤疗效[6]，本研究也证实紫杉醇热敏脂质体联合局部热疗可增加靶向性，增强抗癌疗效，实验中PTL组抗肿瘤效果优于PTX组。长循环热敏脂质体不仅具有热敏特性，还可延长在体内循环时间，达到长循环的目的[7]。本实验证实紫杉醇长循环热敏脂质体联合局部热疗能明显抑制Lewis肺癌荷瘤鼠移植瘤的生长。PLTL组的肿瘤质量抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率均明显高于PTL组，且差异有统计学意义，充分体现长循环特性，主要因为PEG修饰脂质体降低了RES对药物的吞噬，降低脂质体的血液清除率，延长PLTL在血液中的循环时间，增加药物与肿瘤组织的接触机会[8]。

化学治疗药物毒副作用较大，本次实验中PTX组小鼠治疗后出现精神萎靡、毛色暗淡等症状，PTX组和PTL组体质量下降也较PLTL组明显，可见PLTL的毒副作用相对较低。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.006

Inhibitory Effect of Paclitaxel Long-circulating Thermo-sensitive Liposome on Lewis Lung Cancer Cells in Mice

LI Meibo, GU Shengjiu, ZHAO Wenpeng, ZHU Kaimei

(SchoolofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To observe the effect of paclitaxel long-circulating thermo-sensitive liposome (PLTL) on inhibiting the growth of transplanting Lewis lung cancer cells in C57BL/6 mice. Methods The model of mice carried Lewis lung cancer was established.40 tumor-bearing mice were divided into five groups randomly: blank control group, model control group, PTX group, PTL group and PLTL group, 8 mice for each group.The blank control group and the model control group were injected with 0.9% sodium chloride solution.In PTX group, PTL group and PLTL group, the dose of per injection was calculated with the reference of PTX for 20 mg·kg-1, diluted with 0.9% sodium chloride solution, and the mice were injected via the tail vein with a volume of 0.2 mL each time.Except for the blank control group, 5 minutes after administration, the tumors of the other groups were subjected to local hyperthermia at (42±0.5) ℃ for 30 min.During the treatment period, transplantation tumor growth was observed； pathological morphology changes of tumor tissues and cells were detected by HE stain； apoptosis rate of tumor cells was determined by flow cytometry to investigate the inhibition effect of PLTL combined with local thermal therapy on the tumor. Results The inhibition rate of tumor in model control group, PTX group, PTL group and PLTL group was 21.81%, 48.87%, 57.22% and 78.87%, respectively.The apoptosis rate of tumor cells was (20.4±4.2)%, (42.7±3.8)%, (54.6±2.9)% and (69.7±5.0)%, respectively.Observed by pathology, apoptosis rate and necrosis number of tumor cells in PLTL group were significantly increased. Conclusion Compared with PTX and PTL, PLTL has an evident thermo-sensitive feature and can increase the anticancer effect of paclitaxel remarkably when combined with local hyperthermia.

Paclitaxel； Liposome, thermo-sensitive, long-circulating；Cancer, lung

2014-02-10

2014-04-18

*广西科技攻关项目(桂科能129825-21，桂科合14123001-22)；广西教育厅项目(201202ZD065，2013YB154)；桂林市科技攻关项目(20140105-11，20140122-5，20140105-5，20140105-6，20130103-8，20130103-9，20130113-1，2013lX080)

李美波(1985-)，女，湖北襄阳人，硕士，从事药物抗肿瘤基础研究。电话：(0)13557739982，E-mail：gllimb@163.com。

朱开梅(1967-)，女，广西桂林人，教授，硕士，主要从事化学致病分子机制和药物防治研究。电话：(0)18978345717，E-mail：glzkm@163.com。

R979.1；R965；R734.2

A

1004-0781(2015)06-0726-04