核桃仁提取物对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力和海马区神经元的保护作用*

付艾妮，朱书秀，艾永循，付蔷

(江汉大学医学院中医系，武汉 430056)

核桃仁提取物对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力和海马区神经元的保护作用*

付艾妮，朱书秀，艾永循，付蔷

(江汉大学医学院中医系，武汉 430056)

目的 比较3种核桃仁提取物对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆能力及海马区超微病理的影响。方法 采用Meynert基底核注射Aβ1-40建立AD模型，造模成功后随机分为核桃仁-水组、核桃仁-乙醇组和核桃仁-丙酮组，模型对照组，每组10只。另外选取正常对照组10只和假手术组10只。模型对照组不进行灌胃治疗；核桃仁-丙酮组、核桃仁-乙醇组和核桃仁-水组于造模成功后分别灌胃给予核桃仁丙酮提取物、乙醇提取物、水提取物(相当于生药0.3 g·mL-1)，灌胃剂量为3 g·kg-1。以Morris水迷宫评价大鼠学习记忆能力，用透射电镜观察神经元超微结构。结果 核桃仁-丙酮组、核桃仁-乙醇组、核桃仁-水组在前3 d寻找平台的时间下降较迅速，第3天分别为(51.80±4.37)，(61.20±4.67)，(59.63±5.24)s，模型对照组为(67.67±6.12)s，从第3天开始趋于平稳，与模型对照组比较，仍差异有统计学意义(P<0.05)，以核桃仁-丙酮组效果最佳(P<0.01)，海马区神经元超微结构基本正常。结论 核桃仁丙酮提取物具有较好防治AD的作用。

核桃仁；阿尔茨海默病；学习记忆能力；超微结构

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以进行性记忆和认知功能障碍为主要临床表现的神经系统退行性疾病，为人类继心脑血管疾病和肿瘤之后的第三大死因[1]。其发病机制目前有遗传学、β淀粉样蛋白学、胆碱能损伤学等多种学说，典型的病理学特征为老年斑、神经原纤维缠结、神经元减少及颗粒空泡变性等[2]。临床治疗大多采用改善胆碱能神经元功能的药物、激素类药物、非甾体抗炎药等，但这些药物仅能改善部分临床症状，并不能有效阻断病情发展。祖国医学认为该病“病位在脑，肾精亏虚为本”。核桃具有补肾、温肺、润肠、强身健脑之功，被历代医家和养生学家视为益寿精品[3-4]。目前对核桃仁大多从抗氧化、抗衰老、改善小鼠学习记忆能力进行研究[5]，但哪种成分起作用尚不清楚。水、丙酮、乙醇为常用中药有效成分提取剂，由于性质不同，提取的有效成分不同。本课题组[6]前期研究发现：核桃仁提取物可改善AD小鼠脑内免疫炎性反应，提高抗氧化能力，由此推测，核桃仁可能通过此途径影响神经元的超微结构，减少神经元细胞变性和坏死。笔者在本研究对核桃仁分别采用水、乙醇、丙酮进行提取，并将3种提取物灌胃治疗AD模型大鼠，观察其对AD模型大鼠海马区神经元超微病理的影响以及学习记忆能力的保护作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 3个月龄健康清洁级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠60只，雌雄各半，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2004-0007。室温(22±2) ℃，相对湿度(55～65)%，光照适度，通风洁净良好。

1.2 材料 核桃为陕西产，由江汉大学付蔷讲师鉴定并提取。核桃仁水提取物、核桃仁乙醇提取物、核桃仁丙酮提取物(取核桃仁，晒干，粉碎，加水浸泡24 h，分别使用水、乙醇和丙酮提取至核桃仁生药质量浓度为1 g·mL-1，置于4 ℃冰箱内备用。Aβ1-40(美国Biosource公司，批号：25315-01s，Aβ孵育：Aβ1-40加入0.1%三氟乙酸后放入38 ℃水浴恒温箱孵育48 h，使其成为凝聚状态备用。

1.3 仪器 AD造模器材：WDT-Ⅱ微电极推进器脑立体定位仪(国营西北光化学仪器厂)，台式牙钻机(成都康发医疗器械有限公司)，微量注射器(上海医用仪器厂，规格：5 μL)；Morris水迷宫(中国医学科学院生产)，FEI Tecnai G212透射电镜(美国)。

1.4 AD动物模型的制作 参照文献[7-8]进行，采用腹腔注射10%水合氯醛(380 mg·kg-1)进行麻醉，固定于脑立体定向仪，以前囟为原点，旁开3.0 mm，向后1.4 mm为穿刺点，采用微量注射器自脑表面进针7.0 mm，针尖至Meynert基底核，将孵育好的Aβ1-40在2 min内缓慢注入，每次注射1 μL(5 μg)，留针10 min，使Aβ1-40充分浸润局部组织，注射完毕后，在7 min内缓慢抽出微量注射器，缝合表皮。假手术组注射等量0.9%氯化钠注射液。所有操作均在无菌条件下进行，术后每只大鼠腹腔注射青霉素1万U，缝合切口，常规饲养。造模完成后第31天，对大鼠进行Y字型水迷宫筛选，凡15次测试中正确次数较造模前下降1/3者为造模成功[9]。

1.5 动物分组与给药 正常对照组10只，不进行任何处理及治疗，假手术组10只，不进行灌胃治疗。将造模成功动物随机分为模型对照组、核桃仁-丙酮组、核桃仁-乙醇组、核桃仁-水组，每组10只。模型对照组不进行灌胃治疗；核桃仁-丙酮组、核桃仁-乙醇组和核桃仁-水组于造模成功后分别灌胃给予核桃仁丙酮提取物、乙醇提取物、水提取物(相当于生药0.3 g·mL-1)，灌胃剂量为3 g·kg-1。每日1次，每6 d为一个疗程，每疗程结束后休息1 d，连续治疗4个疗程。

1.6 行为学测试

1.6.1 定位航行实验 采用Morris水迷宫进行定位航行训练，水温控制约为25 ℃，每日上、下午各4次，将大鼠面向池壁分别从4个象限放入水中，记录大鼠在2 min内寻找到平台的时间(潜伏期)。如果在2 min内未找到平台，则牵引至平台上，让大鼠停留10 s，再放回笼中，其潜伏期计为120 s。实验历时5 d。

1.6.2 空间探索实验 第6天撤除平台，将大鼠任选1个入水点放入，记录其2 min 内，跨越原平台象限的次数与整个象限次数之比(简称原平台象限跨越次数比)；在原平台象限内的游泳时间与总时间之比(简称原平台象限游泳时间比)。

1.7 电镜观察 在行为学测试完成后第2天，将大鼠处死，并立即置于冰台，分离海马组织，置于2%戊二醛1～3 h，1%磷酸盐缓冲液漂洗3 h，1%锇酸固定1～2 h，环氧树脂包埋，聚合2 d后制作超薄切片，片厚0.5～2.0 μm，透射电镜下观察并摄像。

2 结果

2.1 定位航行实验结果 见表1。模型对照组和药物组经过5 d学习训练后，寻找平台时间较以前均有明显缩短，而且随着训练次数的增加，寻找平台的时间越来越短，说明各组大鼠经过学习训练后均逐渐学会了寻找平台。但实验中发现：正常对照组和假手术组大鼠经过3 d学习，就学会寻找平台。而模型对照组潜伏期虽有下降趋势，但仍需约60 s才能找到平台，较假手术组和正常对照组潜伏期时间明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)。核桃仁-丙酮组、核桃仁-乙醇组、核桃仁-水组在前3天寻找平台的时间下降较迅速，从第3天开始趋于平稳，但与模型对照组比较，仍差异有统计学意义(P<0.05)，且以核桃仁-丙酮组效果最佳(P<0.01)，但学习记忆能力仍差异有统计学意义。

2.2 空间探索实验结果 6组大鼠在撤除平台后2 min的空间探索实验结果见表2。大鼠对原平台象限的记忆越好，在进行空间探索实验时，跨越原平台象限次数越多，在原平台象限游泳的时间也会越长，时间比和次数比越大。与正常对照组、假手术组比较，模型对照组时间比和次数比均显著减小(P<0.01)，表明大鼠对原平台的记忆力较差；核桃仁-丙酮组、核桃仁-乙醇组、核桃仁-水组大鼠时间比和次数比较模型对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明经核桃仁提取物治疗后，大鼠记忆力有所增强。

表1 6组大鼠定位航行实验结果

t=2.43～10.64，与正常对照组和假手术组比较，*1P<0.01，*4P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01

t=2.43-10.64，Compared with normal control group and sham-operation group，*1P<0.01，*4P<0.05； compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.3 电镜观察 模型对照组海马区可见一些神经细胞变性，胞体缩小，胞膜皱缩，核膜间隙增宽，细胞质和细胞器密度增高，内质网扩张，线粒体肿胀变大、空泡样变；正常对照组和假手术组神经细胞则未出现上述改变，神经细胞胞膜完整，结构清楚，细胞质基质电子密度均匀，未见明显病变。核桃仁-水组、核桃仁-乙醇组、核桃仁-丙酮组神经元细胞核基本正常，核糖体、粗面内质网等细胞器基本正常，但核桃仁-水组可见线粒体空泡样变，内质网扩张，核桃仁-丙酮组可见少量内质网轻度肿胀，核桃仁-乙醇组少数神经细胞可见线粒体轻度肿胀。见图1。

3 讨论

本研究结果表明：AD大鼠海马区可见一些神经细胞变性，学习能力和记忆能力均下降，而正常对照组和假手术组神经细胞未见相应改变，学习记忆能力均优于AD大鼠，经过核桃仁水提取物、乙醇提取物和丙酮提取物灌胃治疗后神经元细胞核基本正常，且学习记忆能力较模型对照组提高，差异有统计学意义。说明AD大鼠脑内神经元细胞出现变性坏死，核桃仁在一定程度上可以保护脑内神经元细胞。脑组织是氧化损伤最易感的器官，研究表明氧化应激是AD的致病原因之一，氧化损伤直接参与AD等多种神经退行性疾病的病理过程[10]。核桃中含有高浓度的抗氧化剂，可延缓衰老、增强学习记忆能力[11-13]。姜秀梅等[14]发现：山核桃楸幼果乙醇浸出液可增强血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活力，降低丙二醛的含量，表明其具有明显的抗氧化作用。本课题组前期研究发现核桃仁提取物可以有效降低AD模型大鼠脑内炎因子IL-1、IL-6的含量[6]。因此，核桃仁提取物可能通过调控脑内免疫炎性反应和氧化应激反应来保护神经元细胞。

表2 6组大鼠空间探索实验结果

t=2.44～5.94，与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01

t=2.44-5.94，Compared with normal control group，*1P<0.01； Compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

A.normal control group；B.sham-operation group；C.model control group；D.Walnutkernel-water group； E.Walnutkernel-ethanol group； F.Walnutkernel-acetone group

Fig.1 Ultrastructure of Hippocampal neuron in six groups of rats

核桃仁水提物的主要成分是皂苷等极性水溶性物质；乙醇提取物主要是黄酮类生物碱；而核桃仁丙酮提取物主要含有不饱和脂质和维生素[15]。本研究表明，核桃仁丙酮提取物对AD模型大鼠脑内神经元细胞的保护作用最理想，海马区仅见少量内质网轻度肿胀。而中枢神经系统神经细胞膜富含不饱和脂肪酸，丙酮提取物效果最理想可能与其含有不饱和脂质有关，有用于AD治疗的潜在价值，但其具体成分有待进一步分析鉴定。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.005

Protection of the Extracts ofWalnutkernelon Learning and Memory Abilities and Hippocampal Neuron in Rat Model of Alzheimer's Disease

FU Aini，ZHU Shuxiu，AI Yongxun，FU Qiang

(DepartmentofTraditionlChineseMedicine，CollegeofMedicineScienceofJianghanUniversity，Wuhan430056，China)

Objective To compare the influence of three kinds ofWalnutkernelextracts on learning and memory ability as well as ultrastructural pathology in hippocampus of Alzheimer's disease (AD) rats. Methods AD rat model was established by injection of amyloid-beta protein (Aβ1-40) into the nucleus basalis of meynert.The AD rats were randomly divided intoWalnutkernel-water group，Walnutkernel-ethanol group，Walnutkernel-acetone group，and the model control group，10 rats in each group.In addition，10 rats of normal control group and 10 rats of sham operation group were selected.The model control group was not treated； the treatment groups were intragastrically givenWalnutkernelwater extract，ethanol extract，and acetone extract (the equivalent of pharmacognosy 0.3 g·mL-1)，respectively，dose 3 g·kg-1.The learning and memory ability was studied by Morris water maze，and ultrastructure of neurons was observed under the transmission electron microscopy. Results The time of looking for platform inWalnutkernel-water group，Walnutkernel-ethanol group，andWalnutkernel-acetone group were dropped swiftly at the beginning of 3 days， the third day is (51.80±4.37)，(61.20±4.67)，and (59.63±5.24)，respectively； the model control group is (67.67±6.12) s.Compared with the model control group，the differences were significance (P<0.05)； However，the acetone extract ofWalnutkernelcan obviously enhance the learning and memory ability (P<0.01)，and the ultrastructure almost returned to normal. Conclusion The acetone extracts ofWalnutkernelhave the function of preventing Alzheimer's disease.

Walnutkernel； Alzheimer's disease； Learning and memory ability； Ultrastructure

2014-08-12

2014-09-20

*武汉市科技攻关项目(200851799524-09)

付艾妮(1962-)，女，湖北武汉人，副教授，学士，研究方向：中医养生及中医老年病的防治。电话：027-84688067，E-mail：whjdfan@163.com。

朱书秀(1973-)，男，湖北监利人，副教授，博士，研究方向：阿茨海默病的针灸防治研究。电话：027-84230392，E-mail：513641769@qq.com。

R285；R742

A

1004-0781(2015)06-0722-04