香加皮杠柳苷对肺癌A549细胞凋亡及Survivin表达的影响*

张静，张超，杨光，单保恩，刘江惠

(河北医科大学第四医院1.康复科；2.科研中心；3.放射科，石家庄 050011)

·药物研究·

香加皮杠柳苷对肺癌A549细胞凋亡及Survivin表达的影响*

张静1，张超2，杨光3，单保恩2，刘江惠2

(河北医科大学第四医院1.康复科；2.科研中心；3.放射科，石家庄 050011)

目的 研究香加皮杠柳苷(CPP)对人肺癌A549细胞凋亡及survivin表达的影响，探讨其抗肿瘤作用及作用机制。方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP处理24，48，72 h对人肺癌A549细胞的抑制作用；应用流式细胞术分析不同浓度CPP(2.50，5.00，10.00 ng·mL-1)分别作用于A549细胞6，12，24，48，72 h对细胞凋亡和凋亡率的影响；应用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光染色法和透射电镜观察CPP处理前后A549细胞凋亡的形态学及超微结构变化；采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测CPP作用后A549细胞中凋亡抑制基因survivin的mRNA表达情况；应用Western blot检测CPP对A549细胞survivin蛋白表达的影响。结果 CPP能显著抑制人肺癌A549细胞的生长，最大抑制率(93.46±2.35)%。流式细胞术结果显示，CPP处理组可见典型的凋亡峰，与对照组比较，A549细胞的凋亡率明显升高(P<0.05)。荧光显微镜下可见CPP处理组A549细胞呈橘红色的凋亡细胞形态。透射电镜下可见经CPP处理的A549细胞体积变小，出现细胞质凝缩，核内染色质凝聚边集于核膜，内质网扩张，细胞质空泡化等凋亡细胞的特征性超微结构改变。RT-PCR结果显示，经CPP处理的A549细胞中survivin mRNA表达降低(P<0.05)，10.0 ng·mL-1CPP组survivin mRNA表达由对照组的(0.928±0.016)降至(0.251±0.012)；Western blot结果显示CPP组细胞中survivin蛋白表达明显减弱。结论 CPP可诱导人肺癌A549细胞发生凋亡，可通过下调survivin基因的mRNA和蛋白表达而发挥诱导细胞凋亡作用。

香加皮杠柳苷；癌，肺，人；细胞凋亡；survivin表达

香加皮(CortexPeriplocae)为萝藦科植物杠柳(PeriplocasepiumBge.)的干燥根皮，是我国的传统中药，主要用于祛风湿，强筋骨[1]。近年来，本课题组研究者对中药香加皮抗肿瘤作用进行研究，发现从中分离纯化得到的单体化合物香加皮杠柳苷(periplocin fromCortexPeriplocae，CPP)具有明显的抗肿瘤活性[2-3]。本实验在前期工作的基础上，通过研究CPP对人肺癌A549细胞凋亡及其相关基因survivin表达的影响，进一步探讨CPP诱导细胞凋亡的抗肿瘤分子机制。

1 材料与方法

1.1 药物与细胞株 CPP由华北制药集团新药研究开发中心分离纯化(含量≥99.8%)[4]。人肺癌A549细胞由河北医科大学第四医院科研中心冻存，用含10% 胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的RPMI-1640完全培养液，于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)条件下，常规0.25% 胰蛋白酶消化传代培养。

1.2 试剂 RPMI-1640培养液、反转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)酶混合物(批号：QPG-061)、Trizol Reagent(批号：15596018)为美国GIBCO公司产品；FCS为杭州四季青生物工程公司产品；胰蛋白酶(批号：T1426)、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，批号：M2128)、吖啶橙(acridine orange，AO，批号：A8120)、溴乙啶(ethidium bromide，EB，批号：E1385)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，批号：P4170)为美国Sigma公司产品；DNA Ladder为华美生物工程公司产品；survivin及β-actin引物由上海生物工程公司合成；兔抗人survivin、β-actin多克隆抗体(批号：RAB0536，FK0097A)为美国Santa Cruz公司产品；RIPA裂解液、辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(批号：ZB-2301)、电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒为北京中杉金桥生物有限公司产品。

1.3 主要仪器 TC2323 CO2恒温培养箱(美国SHELDON公司)，HT2酶标仪(奥地利Anthos公司)，IX70倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，H-7500透射电镜(transmisson electron microscope，TEM，日本日立公司)，Epics-XLⅡ流式细胞仪(flow cytometry，FCM，美国Beckman Coulter公司)，定量PCR仪(美国ABI公司)，凝胶成像分析系统(美国Perkin-Elmer公司)。

1.4 MTT法检测A549细胞的增殖情况 取对数生长期的A549细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数约为1×104个。设对照组和1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP实验组，每组设3个平行孔，置37 ℃、5%CO2培养箱均分别培养24，48，72 h。实验终止前每孔加入5 mg·mL-1MTT 10 μL继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，待结晶溶解后用酶标仪于波长570 nm测定吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)。IR(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.5 FCM检测细胞凋亡和凋亡率 分别取培养6，12，24，48，72 h的对照组和2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP组A549细胞约1×106个，以70%预冷乙醇固定，PI染色，应用流式细胞仪测定细胞凋亡率，进行细胞凋亡分析。

1.6 荧光显微镜下观察细胞凋亡形态 采用AO/EB荧光双染法，分别取对照组和经5.00 ng·mL-1CPP作用48 h的A549细胞约1×105个，用0.25%胰蛋白酶消化收集，将细胞悬液100 μL，加入100 μg·mL-1AO/EB混合荧光染色液4 μL混匀，取1滴立即置荧光显微镜下观察CPP处理前后A549细胞的形态学变化。

1.7 TEM 观察细胞凋亡的超微结构 收集对照组和经5.00 ng·mL-1CPP作用48 h的A549细胞，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗涤、离心，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，经脱水、包埋、切片，铀铅双重染色后，采用透射电镜观察细胞超微结构变化。

1.8 RT-PCR检测survivin基因mRNA表达 取对照组和2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP组作用48 h 的A549细胞，用Trizol提取液提取各组细胞总RNA。按RT-PCR酶混合物试剂盒说明进行实验，以β-actin为内参照，每批PCR均设空白对照，反应35个循环。survivin及β-actin基因的引物序列为[5-6]：survivin上游5′-AGCCCTTTCTCAAGGACCAC-3′，下游5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′，扩增片段大小为363 bp；β-actin上游5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，β-actin下游5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，扩增片段大小为619 bp。将RT-PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统Gel-pro软件分析条带的灰度值，对survivin mRNA表达水平进行半定量分析。

1.9 Western blot检测survivin蛋白的表达 分别收集对照组及经2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP处理的A549细胞，用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法蛋白定量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)1.5 h，将蛋白转至硝酸纤维素膜，封闭过夜，加入兔抗人survivin和β-actin抗体封闭2 h，洗膜30 min，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗封闭1 h，洗涤后加入ECL显影，通过凝胶成像系统摄像分析。

2 结果

2.1 CPP对A549细胞增殖的影响 MTT结果显示，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 ng·mL-1CPP组的A549细胞，在作用24，48，72 h后，细胞增殖均受到不同程度抑制，与对照组比较，细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05)。CPP对A549细胞的增殖抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强，抑制率最高达(93.46±2.35)%，见图1。

2.2 细胞凋亡的FCM检测结果 经过2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP作用48 h后A549细胞可见典型的凋亡峰，随药物浓度增加峰值增高(图2)。3个浓度的CPP处理组A549细胞的凋亡率明显增高，并随药物浓度增加和作用时间延长呈升高趋势，与对照组比较，作用48 h和72 h的CPP各浓度组细胞凋亡率均差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

Fig.1 Effects of CPP at different concentration on the proliferations of A549 cells(n=3)

2.3 细胞凋亡的形态学变化 荧光显微镜下观察AO/EB染色细胞，对照组A549细胞呈正常活细胞形态，大小正常，形态规则，细胞质呈绿色，细胞核为亮绿色。CPP处理组A549细胞呈橘红色，体积缩小，圆形固缩，为典型的凋亡细胞形态(图3)。

表1 CPP对A549细胞凋亡率的影响

与对照组比较，t12 h=-17.208,t24 h=-9.642,-8.707；t48 h=-7.999,-10.346,-17.353；t72 h=-13.675,-16.179,-25.615,*1P<0.05

Compared with control group，t12 h=-17.208,t24 h=-9.642,-8.707；t48 h=-7.999,-10.346,-17.353；t72 h=-13.675,-16.179,-25.615,*1P<0.05

图3 CPP诱导A549 细胞凋亡的AO/EB染色结果(×400)

A.Control group；B.CPP group

Fig.3 AO/EB staining on A549 cell apoptosis induced by CPP(×400)

2.4 细胞凋亡的超微结构改变 TEM下观察可见，对照组A549细胞形态大小规则，染色质均匀分布，细胞器形态结构正常。经CPP处理后的A549细胞，呈典型的凋亡细胞形态，表现为体积变小，胞膜表面微绒毛减少，细胞质凝缩，核内染色质凝聚边集于核膜，内质网扩张，细胞质空泡化等特征性超微结构改变(图4)。结果提示，CPP可诱导A549细胞凋亡。

图4 透射电镜下A549细胞的超微结构变化(×4 000)

A.Control group；B.CPP group

Fig.4 Ultrastructure changes of A549 cells observed by transmission electron microscope(×4 000)

2.5 CPP对survivin基因mRNA表达的影响 RT-PCR检测结果显示，不加RNA的空白对照无任何条带，而对照组和CPP各处理组(2.50，5.00，10.00 ng·mL-1)可见特异性扩增条带，与标准DNA ladder比较，分别为内参照β-actin和survivin，经CPP作用48 h后，A549细胞survivin mRNA的表达量明显减低，随药物浓度增加变化更明显(图5)。半定量结果显示，对照组survivin mRNA的表达量(0.928±0.016)，10.0 ng·mL-1CPP组降至(0.251±0.012)，各浓度组与对照组相比其mRNA表达均差异有统计学意义(均P<0.05)(图6)。提示CPP可使凋亡抑制基因survivin的mRNA表达水平下降。

2.6 CPP对survivin基因蛋白表达的影响 Western blot结果显示，通过灰度分值比较，与对照组比较，CPP组A549细胞中 survivin蛋白表达均明显减弱(图7)。提示CPP可下调survivin基因的蛋白表达水平。

M.100 bp DNA ladder；A.对照组；B.2.50 ng·mL-1CPP组；C.5.00 ng·mL-1CPP组；D.10.00 ng·mL-1CPP组；E.空白对照组

图5 CPP对survivin基因 mRNA表达的影响

M.100 bp DNA ladder；A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group；E.Blank control group

Fig.5 Effects of CPP on mRNA expression of survivin

A.对照组；B.2.50 ng·mL-1CPP组；C.5.00 ng·mL-1CPP组；D.10.00 ng·mL-1CPP组；与对照组比较，*1P<0.05

图6 CPP作用A549细胞前后survivin mRNA相对表达量分析

A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group；Compared with control group，*1P<0.05

Fig.6 Relative mRNA expression of survivin in A549 cells before and after CPP treatment

A.对照组；B.2.50 ng·mL-1CPP组；C.5.00 ng·mL-1CPP组；D.10.00 ng·mL-1CPP组

图7 不同浓度CPP对survivin蛋白表达的影响

A.Control group；B.2.50 ng·mL-1CPP group；C.5.00 ng·mL-1CPP group；D.10.00 ng·mL-1CPP group

Fig.7 Effects of CPP at different concentration on protein expression of survivin

3 讨论

我国是世界上肺癌患者最多的国家，过去30年间，我国肺癌病死率上升46.8%，成为上升速度最快的癌症，预计到2025年，我国每年死于肺癌的人数将近100万人[7-8]。 然而，目前尚缺乏疗效强、不良反应小的抗肿瘤药物，有关研究仍是医学领域关注的热点。

我国是世界上最大的药材生产国，以其传统中草药的理论和数千年临床实践的积累，有着巨大开发潜力和明显的优势[9]。作者通过对大量中草药的抗肿瘤活性筛选，发现中药香加皮(CortexPeriplocae)具有明显的抗肿瘤作用，并从中分离纯化出单体化合物CPP。本实验通过研究CPP对人肺癌A549细胞的诱导凋亡作用和凋亡相关基因survivin的表达情况，探讨CPP的抗肿瘤机制。

细胞凋亡在肿瘤的发生发展中扮演着关键的角色，也是药物发挥抗肿瘤作用的重要机制之一[10-11]。作者在增殖抑制实验发现，香加皮杠柳苷(CPP)能显著抑制人肺癌A549细胞的生长。FCM结果显示，2.50，5.00，10.00 ng·mL-1CPP组A549细胞可见凋亡峰，细胞凋亡率也明显增高。提示CPP可诱导人肺癌A549细胞凋亡。

凋亡细胞具有特征性的形态学改变，本研究应用荧光染色和透射电镜检测细胞形态发现，CPP处理后的A549细胞出现典型的凋亡细胞形态。荧光染色可见正常活细胞呈均匀分布的绿色荧光，而凋亡细胞呈橘红色荧光。透射电镜可见凋亡细胞等超微结构改变。进一步表明CPP能诱导人肺癌A549细胞发生凋亡。

细胞凋亡相关基因survivin是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成员[12-13]，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是至今发现最强的凋亡抑制因子[14]。由于survivin的抗凋亡特性及其在肿瘤发生、发展中的重要作用，使其成为抗癌治疗的理想靶点[15-16]。本实验应用RT-PCR和Western blot方法，从mRNA和蛋白水平检测CPP对A549细胞中survivin表达的影响，结果显示，CPP组A549细胞中survivin的mRNA和蛋白表达均明显减弱。提示CPP诱导细胞凋亡可能与survivin基因的表达下调有关。

以上研究结果从细胞凋亡率、形态学观察以及凋亡抑制基因survivin的检测等角度，初步揭示CPP对人肺癌A549细胞的诱导凋亡作用，survivin可能是CPP抗肿瘤作用机制中的靶分子之一，有待进一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.001

Effects of Periplocin from Cortex Periplocae on Apoptosis of Human Lung Cancer A549 Cells and Expression of Survivin

ZHANG Jing1, ZHANG Chao2, YANG Guang3, SHAN Baoen2, LIU Jianghui2

(1.DepartmentofRehabilitation； 2.ScientificResearchCenter； 3.DepartmentofRadiology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To investigate the effects of periplocin fromCortexPeriplocae(CPP) on apoptosis of human lung cancer A549 cells and expression of survivin, and demonstrate its anti-tumor effect and the possible mechanism. Methods Inhibitory effect of CPP at different concentrations (1.25, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00 ng·mL-1) and for different time length (24, 48, 72 h) on A549 cell proliferation was tested by MTT method.Apoptosis rate of A549 cells treated with CPP at different concentrations (2.50, 5.00, 10.00 ng·mL-1) were measured using flow cytometry (FCM) for 6, 12, 24, 48, 72 h, respectively.The morphological and ultrastructural changes of the apoptosis cells were observed by acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining and transmission electron microscopy (TEM).The effects of CPP on mRNA and protein expression of apoptosis associated gene survivin were assessed by RT-PCR and Western blotting. Results CPP could significantly inhibit the growth of A549, and the inhibition rate reached (93.46±2.35)%.The results of FCM showed that the apoptosis rate of A549 cells treated with CPP was increased significantly as compared to the control group (P<0.05).Meanwhile, typical apoptotic peaks were detected.The characteristic morphological changes of apoptosis were observed in A549 exposed to CPP, including cell shrinkage, the nuclei became yellow-red by AO/EB staining, and typical ultrastructural changes, including nuclear chromatin condensation along the nuclear membrane, vacuolar degeneration of cytoplasm observed by TEM.The result of RT-PCR indicated that survivin mRNA expression decreased obviously in A549 cells exposed to CPP.The protein expression of survivin in A549 cells treated with 10.0 ng·mL-1CPP(0.251±0.012)was weaker than that in control group(0.928±0.016). Conclusion CPP can induce apoptosis in human lung cancer cell lines A549, and the probable mechanism is related to the down-regulation of survivin mRNA and protein.

Periplocin fromCortexPeriplocae； Cancer, lung, human； Cell apoptosis; Expression of survivin

2014-06-04

2014-07-24

*国家自然科学基金资助项目(30772752)

张静(1971-)，女，河北正定人，主任医师，博士，主要研究方向：抗肿瘤研究。电话：0311-86095595，E-mail：zjingzher@163.com。

R730.5；R285.5；R734.2

A

1004-0781(2015)06-0705-06