灵芝多糖联合二甲双胍对2型糖尿病模型大鼠氧化应激的影响*

乔进，窦志华，施忠，吴锋，孟国梁，陈惠，郑惠华

(1.江苏省南通市第三人民医院药剂科，南通 226001；2.南通大学医学院药理学系，南通 226001；3.江苏安惠生物科技有限公司，南通 226006)

灵芝多糖联合二甲双胍对2型糖尿病模型大鼠氧化应激的影响*

乔进1，窦志华1，施忠1，吴锋2，孟国梁2，陈惠3，郑惠华3

(1.江苏省南通市第三人民医院药剂科，南通 226001；2.南通大学医学院药理学系，南通 226001；3.江苏安惠生物科技有限公司，南通 226006)

目的 研究灵芝多糖联合二甲双胍对2型糖尿病大鼠氧化应激的影响。方法 采用斯泼累格·多雷(SD)大鼠高脂饮食4周后，腹腔注射小剂量链脲佐菌素30 mg·kg-1造模。成模后将大鼠随机分为模型对照组、灵芝多糖组(给予灵芝多糖600 mg·kg-1)、二甲双胍组(给予二甲双胍600 mg·kg-1)及联合用药组(给予灵芝多糖300 mg·kg-1+二甲双胍300 mg·kg-1)，另设正常对照组。给药治疗12周末测量大鼠空腹血糖；测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平。结果 用药组空腹血糖水平均低于模型对照组(P<0.01)，其中联合用药组血糖显著低于单独用药组(P<0.01)。与模型对照组比较，用药组血清TC、TG水平明显下降(P<0.05或P<0.01)，与单独用药组比较，联合用药组血清TC、TG水平明显降低(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，用药组血清SOD水平明显升高(P<0.01)；与单独用药组比较，联合用药组血清SOD水平明显升高(P<0.05)。与模型对照组比较，用药组血清MDA水平明显降低(P<0.01)，联合用药组血清MDA较单独用药组明显降低(P<0.05)。与模型对照组比较，用药组血清CAT、GSH-Px水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，联合用药组血清CAT、GSH-Px水平较单独用药组明显升高(P<0.05)。结论 灵芝多糖、二甲双胍联合用药能够有效对抗2型糖尿病大鼠体内氧化应激作用，效果优于单独用药，其机制可能与增强体内SOD、CAT、GSH-Px水平及调节血脂障碍有关。

灵芝多糖；二甲双胍；糖尿病；氧化应激

糖尿病(DM)是由于胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的全身糖、脂、蛋白质代谢紊乱性疾病，以血糖增高为特点，可导致多脏器、多系统损伤。近年来，其发病率逐年上升，已成为继心血管和肿瘤之后威胁人类生命健康的第三大疾病。因此研究和开发防治糖尿病的药物日益受到人们的关注。越来越多的研究表明，实验性糖尿病的发病与氧自由基反应增加和抗氧自由基酶类活性降低密切相关。Brownlee提出的糖尿病并发症的统一机制学说更是引起了广泛关注，其核心是高糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多，导致组织细胞发生氧化应激，最终导致糖尿病的各种并发症[1]。目前西药控制血糖效果良好，但剂量过大易继发耐药和毒副作用等不良后果。灵芝多糖(ganoderma lucidum polyccharide，GLPs)是灵芝中最有效的成分之一，吴锋等[2]研究发现灵芝多糖能抑制大鼠体内氧化应激。二甲双胍为临床常用降糖药之一，具有明显降糖和改善胰岛素抵抗的作用，近年来研究证实其具有对抗氧化应激及防治糖尿病血管并发症的作用[3]。它们联合应用治疗糖尿病具有理论上的优点，在降血糖、抑制体内氧化应激水平的同时可以减少二甲双胍的用量，避免西药的毒副作用及耐药。联合应用这两种药其疗效是否优于单用，笔者尚未见报道。笔者在本实验观察灵芝多糖和二甲双胍联用对2型糖尿病大鼠体内氧化应激的影响，初步探讨其作用机制，为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠80只，雌雄各半，体质量150～180 g，南通大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2014-0001；实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2012-0031。大鼠分笼喂养，自由饮水。

1.2 试剂 灵芝多糖(江苏安惠生物科技有限公司，纯度74.03%，批号：100601)；二甲双胍片(上海信谊天平药业有限公司，批号：67100507，规格：每片0.25 g)。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，批号：110103)，临用前用0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液配成浓度为1% STZ溶液。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒，批号：20110312；丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒，批号：20110313，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒，批号：20110411，过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒，批号：20110411，均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 One Touch血糖仪(强生公司)；7170A全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.4 造模与分组 SD大鼠80只，分成正常对照组和造模组。正常对照组10只，给予普通饲料喂养。造模组70只给予高脂饮食(脂肪20%、奶粉5%、蛋黄粉5%、基础饲料70%)，喂养4周后禁食12～14 h，予STZ 30 mg·kg-1腹腔注射。1周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1即造模成功，继续高脂饮食。取40只成模大鼠随机分为4组：模型对照组，灵芝多糖组，二甲双胍组，联合用药组，每组10只。灵芝多糖组给予灵芝多糖600 mg·kg-1；二甲双胍组给予二甲双胍600 mg·kg-1；联合用药组给予灵芝多糖300 mg·kg-1，二甲双胍300 mg·kg-1。灵芝多糖溶解于0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na)溶液中，二甲双胍溶解于纯净水。每日上午11：00时灌胃给药一次，正常对照组和模型对照组予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，连续给药12周。

1.5 血糖测定 给药前及给药12周末，禁食14～16 h后，经尾静脉取血，血糖仪测空腹血糖。

1.6 血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)测定 尾静脉取血，2 000 r·min-1离心15min，分离血清，测定血清TC、TG含量。

1.7 血清SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平测定 均按试剂盒说明书上操作要求进行测定。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常对照组大鼠外观状态良好，行动自如。模型对照组大鼠一般情况差，饮水量、饮食量、尿量明显增多，体型消瘦，皮毛杂乱无光泽，表现出典型的三多一少症状，实验过程中死亡大鼠5只，其中模型对照组死亡3只，二甲双胍组死亡2只。灵芝多糖和二甲双胍均能减轻大鼠的糖尿病症状，但联合用药组较单独用药组外观改善更为明显。

2.2 空腹血糖 实验前，3组用药组血糖与模型对照组比较差异无统计学意义，模型对照组空腹血糖水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。实验后，3组用药组空腹血糖水平均低于模型对照组(P<0.01)，其中联合用药组血糖显著低于单独用药组(P<0.01)。见表1。

表1 5组大鼠实验前后空腹血糖水平比较

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01；与单独用药组比较，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01；compared with single medication group，*3P<0.01

2.3 大鼠血清TC和TG水平 与正常对照组比较，模型对照组血清TC、TG水平明显升高(P<0.01)；与模型对照组比较，用药组血清TC、TG水平明显下降(P<0.05或P<0.01)；与单独用药组比较，联合用药组血清TC、TG水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 5组大鼠血清TC和TG检测值比较

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01；与单独用药组比较，*4P<0.01，*5P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01；compared with single medication group，*4P<0.01，*5P<0.05

2.4 大鼠血清SOD和MDA水平 与正常对照组比较，模型对照组血清SOD水平明显降低(P<0.01)；与模型对照组比较，用药组血清SOD水平明显升高(P<0.01)；与单独用药组比较，联合用药组血清SOD水平明显升高(P<0.05)。与正常对照组比较，模型对照组血清MDA水平明显升高(P<0.01)；与模型对照组比较，用药组血清MDA水平明显降低(P<0.01)，联合用药组血清MDA较单独用药组明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠血清SOD和MDA检测值比较

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01；与单独用药组比较，*3P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01；compared with single medication group，*3P<0.05

2.5 大鼠血清CAT和GSH-Px水平 与正常对照组比较，模型对照组血清CAT、GSH-Px水平明显降低(P<0.01)；与模型对照组比较，用药组血清CAT、GSH-Px水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，联合用药组血清CAT、GSH-Px水平较单独用药组明显升高(P<0.05)。见表4。

表4 5组大鼠血清CAT和GSH-Px检测值比较

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01；与单独用药组比较，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01；compared with single medication group，*4P<0.05

3 讨论

近年来基础研究发现，氧化应激参与糖尿病及其并发症的发生和发展，过氧化物生成增多或抗氧化物质不足与糖尿病并发症有密切关系[4]。且有研究证实氧化应激是糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一[5]。氧化应激是指机体内氧自由基的产生与清除失去平衡，或外源性氧化剂的过量摄入导致活性氧在体内堆积引起细胞毒性[6]。

干预氧化应激既可从病因上着手，如恢复血糖、血脂的水平；也可从病理的中间环节着手，如切断氧化应激的发生、消除氧化应激产物等。MDA是不饱和脂肪酸氧化的终产物，其含量的高低可反映机体脂质过氧化的程度。因此，测定MDA水平可间接反映细胞受氧化损伤程度，是反映氧化应激较好的指标[7]。同时氧化应激的发生和发展与血清中TC、TG水平有关[8]。高糖、高脂均可刺激产生过氧化产物，过氧化产物损伤血管内皮细胞是糖尿病并发症发病机制中的关键起步[9]。本实验中，模型对照组大鼠血清MDA、TC、TG含量显著升高，3组治疗组血清MDA、TC、TG含量显著下降，且联合用药组比单独给药组下降更明显。SOD、CAT、GSH-Px是体内有效的自由基清除剂，它们的催化活性对维持氧化平衡系统非常重要[10]。在体内高糖环境下，机体一方面清除氧自由基的酶(SOD、CAT，GSH-Px)活性降低，另一方面体内的氧化应激作用增强，造成大量活性氧自由基在体内的积聚，导致活性氧连锁反应，从而促进糖尿病一系列并发症的发生和发展[11]。本研究中，模型对照组大鼠胸主动脉SOD、CAT和GSH-Px活性明显降低(P<0.01)。联合用药组的CAT和GSH-Px活性显著升高(P<0.01)，效果优于单独用药组(P<0.05)，提示在总剂量不变的前提下，灵芝多糖和二甲双胍联合使用能减少TC、TG和MDA含量，降低血脂水平，抑制体内氧化应激的形成，较单独用药组能更好增强机体抗氧化能力。

本实验在2型糖尿病大鼠模型中，灵芝多糖和二甲双胍通过降低血清中TC、TG含量，增强体内清除氧自由基酶的含量来减轻体内氧化应激的形成。联合应用灵芝多糖和二甲双胍在对抗糖尿病机体氧化应激的效果方面明显优于单用。在总剂量不变的情况下联合两种药物可以减少其中一种药物的剂量。本研究中联合用药减少二甲双胍的剂量，同时也降低二甲双胍对降血糖可能带来的不良反应，并降低大鼠的死亡率。联合使用灵芝多糖和二甲双胍可能会成为今后临床治疗糖尿病及其并发症的一个新方向。

[1] 王兰，李新荣，邓湘蕾，等.丹参酮ⅡA对糖尿病大鼠体内氧化应激的作用[J].临床和实验医学杂志，2007，7(6)：8-10.

[2] 吴锋，孟国梁，徐济良，等.灵芝多糖抑制NADPH氧化酶表达防治大鼠动脉粥样硬化[J].中国药理学通报，2012，28(7)：944-947.

[3] ANFOSSI G，RUSSO I，BONOMO K，et al.The cardiov-ascular effects of metformin：further reasons to consider an old drug as a cornerstone in the therapy of type 2 diabetes mellitus[J].Curr Vasc Pharmacol，2010，8(3)：327-337.

[4] 宋爱丽，宋慧芳，肖永红，等.大蒜素联合胰岛素治疗后2型糖尿病患者血浆高敏C反应蛋白和C肽水平的变化[J].中国临床康复，2006，10(35)：122-124.

[5] VICTOR V M，ROCHA M，HERANCE R，et al.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in type 2 diabetes[J].Curr Pharm Des，2011，17(36)：3947-3958.

[6] 杜先华，李海燕，王爽，等.三七总皂苷对H2O2损伤的皮肤成纤维细胞的保护作用[J].时珍国医国药，2011，22(10)：2549-2550.

[7] SEHIRLI O，TOZAN A，OMURTAG G Z，et al.Protective effect of resveratrol against naphthalene-induced oxidative stress in mice[J].Ecotoxicol Environ Saf，2008，71(1)：301-308.

[8] KITAJIMA S，JIN Y，KOIKE T，et al.Lp(a)enhances coronary atherosclerosis in transgenic Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits[J].Atherosclerosis，2007，193(2)：269-276.

[9] BROWNLEE M.The pathobiology of diabetic complicati-ons：a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54(6)：1615-1625.

[10] 吕风亚，李义召，徐龙宪，等.硒对沙土鼠脑缺血-再灌注损伤后MDA、GSH-Px及细胞凋亡的影响[J].卒中与神经疾病，2003，10(4)：198-200.

[11] JOHANSEN J S，HARRIS A K，RYCHLY D J，et al.Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes：linking basic science to clinical practice [J].Cardiovasc Diabetol，2005，4：5.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.004

Effect of Ganoderma Lucidum Polysaccharides Combined with Metformin on Oxidative Stress of Type 2 Diabetic RatsinVivo

QIAO Jin1，DOU Zhihua1，SHI Zhong1，WU Feng2，MENG Guoliang2，CHEN Hui3，ZHEN Huihua3

(1.DepartmentofPharmacy，theThirdPeople’sHospitalofNantongCity,Nantong226001,China； 2.DepartmentofPharmacology,MedicalCollege,NantongUniversity，Nantong226001,China； 3.JiangsuAnhuiBiologicalTechnologyCo.Ltd,Nantong226006,China)

Objective To study the effect of ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin on oxidative stress of type 2 diabetic rats. Methods SD rats were fed with high fat diet for 4 weeks and injected with streptozotocin (30 mg·kg-1) to produce type 2 diabetic model.The diabetic rats were randomly divided into diabetes model group, ganoderma lucidum polysaccharides group (600 mg·kg-1), metformin group (600 mg·kg-1), combination group (ganoderma lucidum polysaccharides 300 mg·kg-1+ metformin 300 mg·kg-1), After 12 weeks of treatment, the level of fasting blood glucose was determined, and the activity of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were detected. Results The levels of fasting blood glucose in the treatment groups were significantly lower than that in the diabetes model group (P<0.01).Furthermore, fasting blood glucose in the combination group was significantly lower than that in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.01).Compared with diabetes model group, serum TC and TG in the treatment groups were significantly lower (P<0.05,P<0.01).Serum TC and TG were significantly lower in the combination group than in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05,P<0.01).Compared with diabetes model group, serum SOD levels in the treatment groups were significantly higher (P<0.01).Compared with ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group, serum SOD levels in the combination group was significantly higher (P<0.05).Compared with diabetes group, serum MDA levels in the treatment groups were significantly lower (P<0.01).Serum MDA in the combination group was significantly lower than that in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05).Compared with diabetes model group, serum CAT and GSH-Px in the treatment groups were significantly higher (P<0.05,P<0.01).Serum CAT and GSH-Px in the combination group were significantly higher than those in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05). Conclusion Ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin could effectively inhibit oxidantion stress in type 2 diabetic rats.The effect was better than ganoderma lucidum polysaccharides or metformin used alone.The possible mechanism may be related to increased activity of SOD, CAT, GSH-Pxinvivoand regulation of dyslipidemia.

Ganoderma lucidum polyccharide； Metformin； Diabetes mellitus； Oxidative stress

2014-05-08

2014-08-05

*科技部十一五国家科技支撑计划子课题项目(2006DAI06A20-02)；江苏省优势学科项目

乔进(1985-)，男，江苏扬州人，主管药师，硕士，主要从事心血管药理及临床药理研究。电话：(0)13901485175，E-mail：felix_jo@163.com。

窦志华(1966-)，男，江苏南通人，主任中药师，硕士生导师，博士，主要从事中药药效物质基础及创新中药研究。电话：0513-85116078，E-mail：zhihuadou@163.com。

R977.15；R965；R589

A

1004-0781(2015)06-0718-04