结核分枝杆菌异质性所致的基因耐药与表型耐药不一致的研究进展

张丽霞(综述)，邵世峰(审校)

(国家中医药管理局中医药防治传染病重点实验室 天津市海河医院检验科，天津 300350)



结核分枝杆菌异质性所致的基因耐药与表型耐药不一致的研究进展

张丽霞(综述)，邵世峰※(审校)

(国家中医药管理局中医药防治传染病重点实验室 天津市海河医院检验科，天津 300350)

摘要：结核病治疗和防治是全球性公共卫生问题，治疗中抗结核药物的不规范使用,加上患者的依从性差，造成了结核菌耐药率不断增高，成为目前治疗上的难题之一。结核菌耐药有多种原因，其中异质性是结核菌耐药的一个微小变化过程。临床检验中由于常规方法的局限性无法检测频率过低的菌株而造成耐药结果的偏差，出现了同一标本不同方法药敏试验结果不一致的现象，提示结核分枝杆菌的异质性对药敏结果有影响。

关键词：结核分枝杆菌；异质性耐药；表型耐药；基因耐药

当前，耐药性问题是结核病最重要的问题之一,特别是耐多药结核病、严重耐药结核病的出现给结核病的治疗带来了更大的困难[1]。世界卫生组织估计约2/3的结核病患者处于耐多药的危险之中[2]。所以，药敏试验的正确判断和耐药监测对结核病控制和流行病学统计起着重要作用。因此，研究结核菌耐药机制，掌握各种检测方法的特性，快速、准确地给临床提供治疗依据是每个实验室工作者追寻的目标。传统的结核菌检测方法具有金典性，但随着基因检测技术的发展，结核菌快速鉴定和药敏试验为患者治疗提供了更为有利的条件。目前结核耐药基因技术已走向临床，对结核患者进行快速筛查和药敏分析已成为必然趋势，现就基因耐药和表型耐药结果不一致现象予以综述。

1结核分枝杆菌基因的研究

传统的结核菌基因分型技术以核酸为主，从表型特征上认识细菌，主要有噬菌体分型、血清分型、药物敏感试验分型、细胞蛋白电泳、生物化学多样性分析等。随着科技的进步和方法学的变化，目前多采用限制性片段长度多态性、间隔区寡核苷酸分型技术、可变串联重复序列技术、单核苷酸多态性分析、长片段多态性等来分析。限制性片段长度多态性方法具有较高的分辨率和菌株鉴别的能力；间隔区寡核苷酸分型技术是基于染色体上直接重复区位点的多态性，方法简便、重复性高、只需少量DNA，被公认为北京家族菌株鉴定的金标准[3]；可变串联重复序列技术被美国疾病预防中心推荐为结核分枝杆菌基因分型的首选方法，其操作简便、快速、成本低，以聚合酶链反应为基础，也被称为可变串联重复序列技术[4]。目前采用的线性探针检测技术可检测出结核分枝杆菌的rpoB、katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA以及编码外排泵蛋白质的efpA、iniA、iniB、 iniC基因等[5]。近年来，随着分子生物学技术日趋成熟，对结核分枝杆菌的基因及耐药机制进行了更加深入的研究，定位了结核分枝杆菌耐药基因的位置、基因突变位点和药物的关系来判断耐药性，使人们对结核病的流行特点和传播有了更深刻的理解和掌控。

2耐药的概念、机制与检测方法

2.1耐药的概念及机制结核病分为直接感染耐药结核菌引起的原发耐药和结核分枝杆菌菌株基因组发生突变而产生的获得性耐药[6]。原发性耐药指从未因结核病而被治疗过的患者，或曾因结核病被治疗过但少于1个月的患者，他们带有一种或多种抗结核药物耐药结核分枝杆菌；而获得性耐药是指结核患者开始接受抗结核药物治疗后，在治疗过程中结核分枝杆菌产生一种或多种抗结核药物的耐药性[7]。目前结核杆菌发生耐药的机制可从细胞水平与分子水平来分析，细胞水平的耐药机制与结核杆菌对抗结核药物的耐药概率、疗效、病灶中细菌数量及药物种类的应用有直接的关系，病灶中结核杆菌数量越大，突变概率越大，耐药的机会也越多[8]。单一用药耐药的概率大于联合用药，用药数量越多、耐药的机会越少，耐多药结核病的发生率也越低[9]；分子水平上的耐药机制与细胞膜通透性、产生降解或灭活酶类、药物的作用靶位相关[10]。另外，染色体突变介导的药物靶编码基因的各种突变基因，是结核分枝杆菌耐药的主要分子机制[11]。

2.2检测方法目前我国检测结核分枝杆菌药敏试验的方法主要有传统的固体检测法(包括比例法、绝对浓度法和耐药性法)和现代的快速培养仪系统(常用的有全自动分枝杆菌检测仪、全自动血培养仪及显微镜观察药物敏感性检测)[12]；近代的线性探针技术、基因芯片测序等技术也逐步应用于结核病快速诊断和耐药基因突变的临床检测中[13]。各种方法都有各自的敏感性和特异性，由于操作者不同而存在较大差异。绝对浓度法在判断上未对“敏感”和“耐药”下明确定义，仅记录培养基上菌落生长的丰度来报告，结果不直观，人为因素多，给药敏试验室间质控带了困难；相比之下，比例法对药物敏感试验中接种量进行了校准，它采用了两种菌液浓度(10-2mg/mL和10-4mg/mL)，通过计算活性单位的比值获得，使结果更加精准，定义1%为“敏感”和“耐药”的临界点[14]。全自动分枝杆菌检测/药敏系统是目前常用的液体快速检测方法，该方法在分枝杆菌生长指示管底部包埋荧光感应器，对培养基内溶解的氧气敏感，加入标本孵育后若无细菌生长培养基内大量的氧气抑制荧光感应器发出荧光，仪器检测为阴性；如有细菌生长则消耗培养基内氧气，激活荧光感应器发出荧光，仪器检测荧光强度增强，仪器检测为阳性，一般在标本培养后的4～12 d内报告阳性结果。自动液体培养系统比传统固体培养基显示了较好的敏感性和检测快速的优点[15-16]。但由于药敏种类少不能更好地满足临床需求，不能有效筛查严重耐药结核病菌株，所以也同时使用传统的固体培养法对二线药及氟喹诺酮药物的监测，因此也就出现了在实际工作中遇到的同一标本，同一种药物两种方法药敏结果判断不一致的现象。对此，O′Grady等[17]报道，通过不同药敏测试方法在检测时间、准确性、实用性、菌液浓度等方面的比较得出，结果不符的原因可能与菌株低水平的耐药有关，也可能是因为该菌落中耐药和敏感的亚群比例不同。宿主的多态性、结核菌敏感和耐药的数量或菌种的异质性是造成细菌是否耐药的主要原因[18-19]。

3结核分枝杆菌异质性耐药的产生

异质性耐药是指在同一标本中同时存在敏感菌和耐药菌的现象，这体现了细菌群体从部分耐药向完全耐药的微小转变过程。临床标本中存在同一患者相同时间分离的标本液体法和固体法药敏结果不一致的现象，究其原因是实验室污染、多重感染、异质性耐药、检测方法问题或是细菌本身对药物敏感性不均一问题，这些问题的存在对结核病的耐药性诊断及治疗提出了挑战。目前国内外对同一患者同次送痰的两种方法药敏结果不一致的菌株进行分析的文献还较少，有学者报道用高通量测序技术研究了结核患者体内结核分枝杆菌异质性耐药的发展过程，发现在异烟肼耐药性产生的早期同一细菌菌体中同时存在4～5种与异烟肼耐药相关的突变，证明了异质性耐药的真实存在[20-21]。

4研究异质性耐药结核分枝杆菌的临床意义

异质性耐药是从敏感菌向耐药菌转变的过程，研究异质性耐药能加深对耐药结核病发生、发展过程的认识，异质性耐药标志着细菌突变数量的多少和用药剂量的大小。在进行耐药性评价时，不仅要考虑到方法学的差异，还应考虑是否存在多重感染、继发感染及混合感染等。因此，临床上在进行药物敏感性监测时要选择灵敏性高的诊断方法，对耐药菌特别是适应性高的耐药菌筛查要注意方法的敏感性，尽早采用先进的基因技术预测药物的敏感性，避免异质性耐药的出现造成结果的偏差和误导治疗方案的确立；同时，了解其耐药程度，采取个体化用药，真正有效控制耐药结核病的传播，防止和延缓结核菌向耐多药、严重耐药发展。另外，异质性耐药又存在于结核菌初始变化过程中，研究异质性耐药对评估结核病疗效也具有重要意义。对结核分枝杆菌异质性耐药的认识以及是否在临床中采取不同的治疗措施[22]，在细菌群体数量较少的时候进行个体化治疗，来降低耐药细菌的产生，还有待大量临床数据的支持和研究[23-25]。

5小结

比例法、绝对浓度法和全自动分枝杆菌检测/药敏系统、全自动血培养检查系统以及显微镜观察药物法、线性探针、基因测序、结核分枝杆菌/核酸检测等技术都在不同阶段为结核病的控制和治疗起着重要作用。异质性耐药是细菌对抗抗生素的一个效应过程，也是对治疗方案的选择、疗效评价的一个验证。研究结核菌的异质性耐药，必将为早期发现结核病、减缓结核菌耐药起到积极作用。

参考文献

[1]Russell DG,Barry CE,Flynn JL.Tuberculosis:what we don′t know can,and does,hurt us[J].Science,2010,328(5980):852-856.

[2]Feuerriegel S,Oberhauser B,George AG,etal.Sequence analysis for detection of first-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis strains from a high-incidence setting[J].BMC Microbiol,2012,12:90.

[3]董毅,吴利先.结核分枝杆菌基因分型技术的研究进展[J].国际流行病学传染病学杂志，2013,40(5):336-339.

[4]Zhang L,Chen J,Shen X,etal.Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai,China[J].FEMS Microbial Lett,2008,282(1):22-31.

[5]Mulenga C,Shamputa IC,Mwakazanga D,etal.Diversity of Mycobacterium tuberculosis genotypes circulating in Ndola,Zambia[J].BMC Infect Dis,2010,10:177.

[6]Gandhi NR,Nunn P,Dheda K,etal.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis:a threat to global control of tuberculosis[J].Lancet,2010,375(9728):1830-1843.

[7]Yoshiyama T.Management of multiple drug-resistant tuberculosis[J].Kekkaku,2013,88(11):749-756.

[8]马淑香.结核杆菌的耐药机制综合分析[J].中国保健,2010,18 (7):14-15.

[9]刘朋冲，阎锡新，李志惠，等.基因芯片技术检测方法对耐多药肺 结核治疗的指导价值研究[J].临床肺科杂志，2014,19(4)：682-684.

[10]谢明章,陈昌杰.结核分枝杆菌耐药的分子机制及分子生物学检测方法进展[J].分子诊断与治疗杂志，2010,2(5):348-352.

[11]赵龙凤，张缭云.结核病的现代诊断与治疗[M].北京:中国医药科技出版社，2001：523.

[12]武洁，桂晓虹，李静，等.比例法与绝对浓度法检测结核分枝杆菌药敏试验的比较[J].中华检验医学杂志,2011,34(2):137-138.

[13]赵冰，时金艳，逄宇,等.基因芯片结核分枝杆菌耐多药检测在地市级实验室的应用性评估[J].中国防痨杂志,2013,35(9):718-722.

[14]刘宇红,王民，那希宽.比例法测试结核分支杆菌药物敏感性的探讨[J].中华结核和呼吸杂志,2000,23(2):89-91.

[15]Diacon AH,Maritz JS,Venter A,etal.Time to detection of the growth of Mycobacterium tuberculosis in MGIT 960 for determining the early bactericidal activity of antituberculosis agents[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(12):1561-1565.

[16]孙美兰，陈晓，华永川.BACTEC MGIT960系统在分枝杆菌属菌种初步鉴定及药敏中的应用[J].中华医院感染学杂志,2011,21(11):2372-2374.

[17]O′Grady J,Maeurer M,Mwaba P,etal.New and improved diagnostics for detection of drug resistant pulmonary tuberculosis[J].Curr Opin Pulm Med,2011,17(3):134-141.

[18]Ford CB,Lin PL,Chase MR,etal.Use of whole genome sequencing to estimate the mutation rate of Mycobacterium tuberculosis during latent infection[J].Nat Genet,2011,43(5):482-486.

[19]李琦，张逸彪，雷敏.2008-2011年结核分枝杆菌的耐药性变迁[J].中华医院感染学杂志,2013,23(19):4841-4843.

[20]Müller B,Borrell S,Rose G,etal.The heterogeneous evolution of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis[J].Trends Genet,2013,29(3):160-169.

[21]柳清云，孙刚，高谦.结核分枝杆菌(MTB)异质性耐药研究进展[J].复旦学报：医学版,2013,40(1):1-3.

[22]Caminero JA,Sotgiu G,Zumla A,etal.Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis[J].Lancet Infect Dis,2010,10(9):621-629.

[23]Marusyk A,Almendro V,Polyak K.Intra-tumour heterogeneity:a looking glass for cancer?[J].Nat Rev Cancer,2012,12(5):323-334.

[24]Blakemore R,Story E,Helb D,etal.Evaluation of the analytical performance of the Xpert MTB/RIF assay[J].J Clin Microbiol,2010,48(7):2495-2501.

[25]Van Deun A,Martin A,Palomino JC.Diagnosis of drug-resistant tuberculosis:reliability and rapidity of detection[J].Int J Tuberc Lung Dis,2010,14(2):131-140.

Research Progress of Inconsistent Results Caused by the Heterogeneity of Mycobacterium Tuberculosis Gene and Phenotypic Drug ResistanceZHANGLi-xia，SHAOShi-feng.(KeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControlofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinHaiheHospital，Tianjin300350，China)

Abstract：Tuberculosis(TB) treatment and prevention is a global public health problem,due to the irregular use of anti-TB drugs,plus poor compliance of the patients,TB drug resistance is increasing continuously,and has become one of the difficulties in clinical.There are many causes of TB drug resistance,and heterogenicity is a small change process,where clinical testing cannot detect low frequency drug-resistant strains because of the limitations of conventional methods,resulting in inconsistent results of the same specimen by different tests,which indicates heterogeneity influences on the drug sensitivity test.

Key words:Mycobacterium tuberculosis; Heterogeneous resistance; Phenotypic resistance; Gene resistance

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-01-16编辑：郑雪

基金项目：天津市卫生局课题(2014K2035)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.012

中图分类号：R446.5

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)14-2526-03