纤溶酶对实验性脑梗死的预防作用及对血浆血栓前体蛋白的影响

梁晓玲,王世斌

(解放军北京军区太原药品器材供应站,山西 太原 030012)

纤溶酶对实验性脑梗死的预防作用及对血浆血栓前体蛋白的影响

梁晓玲,王世斌

(解放军北京军区太原药品器材供应站,山西 太原 030012)

目的 观察纤溶酶对实验性脑梗死大鼠的预防作用及对血栓前体蛋白(TpP)水平的影响。方法 将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及纤溶酶低、中、高剂量组，每组10只。除假手术组外，其余各组均建立脑梗死模型，其中纤溶酶低、中、高剂量组分别于手术前30 min经尾静脉给予纤溶酶1 ，2，4 IU/10 g，假手术组和模型组给予等量生理盐水。手术成功后6 h从心脏取血、测定血浆中TpP水平，取脑测定脑梗死体积。结果 纤溶酶低、中、高剂量组梗死面积百分比、TpP水平均明显低于模型组(P均<0.05)；纤溶酶高剂量组梗死面积和百分比明显低于低剂量组(P<0.05),血浆TpP水平明显低于中、低剂量组(P均<0.05)。结论 纤溶酶对实验性脑梗死具有预防作用，并能降低TpP水平。

纤溶酶；血栓前体蛋白；纤维蛋白原；脑梗死

纤溶酶是应用单克隆抗体纯化技术制备的一类新型降纤药[1]，可以改善患者临床症状，预防血栓的发生和发展，可用于脑梗死、心肌梗死、下肢深静脉血栓等血栓性疾病的预防和治疗。血栓前体蛋白(TpP)是纤维蛋白原形成血栓前的中间过渡体，在脑梗死患者中，TpP在梗死3 h内就达到正常值的3～5倍，这为脑梗死早期诊断与及时溶栓提供了可靠的临床依据[2]；在血栓性疾病,尤其急性冠脉综合征[3]、脑梗死[4]的早期诊断中具有重要意义。在脑梗死早期诊断中，TpP比影像学CT[5]、磁共振更具优势[6]。而在其他血栓类疾病中，如下肢深静脉栓塞[7]、肿瘤[8]、弥散性血管内凝血[9]等，TpP也有着特殊的诊断意义。临床中纤溶酶可有效防治血栓类疾病的发生发展，但纤溶酶是否能通过自身活性作用降解TpP尚少见报道。本研究观察了纤溶酶预防大鼠实验性脑梗死的作用及对TpP的影响，旨在为其临床应用提供新的理论依据。

1 实验资料

1.1 主要试剂和仪器 注射用纤溶酶(北京赛升药业股份有限公司提供，批号：201305171)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(E.MERCK公司)；TpP酶联免疫吸附法定量检测试剂盒(上海迪奥生物科技有限公司)；分光光度计；Bioelisa Reader Elx800酶标仪(美国Bioelisa 公司)；ThromboScreen400C血凝仪(美国太平洋公司)；全自动生化分析仪。

1.2 实验动物及分组 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量180～250 g，由北京实验动物中心提供。50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、纤溶酶低、中、纤溶酶高剂量组，每组10只。

1.3 模型制备及组给药 纤溶酶低、中、高剂量组分别于手术前30 min经尾静脉给予注射用纤溶酶1，2，4 IU/10 g，假手术组和模型组给予等量生理盐水。PE-50导管(外径0.3 mm，内径0.2 mm)经一软管接微量加样器，手术前充满凝血酶(1×106IU/L)。各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠30～40 mg/kg麻醉，分离双侧颈总动脉、左侧颈外动脉、颈内动脉及翼腭动脉。颈动脉分叉远端7～10 mm处结扎颈外动脉、翼腭动脉，使颈内动脉成为颈总动脉唯一供血动脉。微动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉。导管经颈外动脉距分叉处3 mm处插入，并进入颈内动脉，移走颈内动脉上的微动脉夹，继续插入15 mm，抽取10 μL动脉血进入导管，停留10 min以形成栓子。暂时用微动脉夹夹闭对侧颈总动脉，然后将凝血酶连同栓子注入颈内动脉，5 min后移走右侧颈总动脉上的微动脉夹；10 min后拔出导管，结扎颈内动脉近端；15 min后移走左侧颈总动脉上的微动脉夹，缝合皮肤。假手术组手术操作和结扎动脉与手术组相同，但导管内充满生理盐水，不在导管内形成栓子。

1.4 TpP浓度测定 手术成功6 h后从大鼠心脏取血2 mL，收集于含肝素抗凝剂的试管中，血液与抗凝剂比例为9：1。全血标本于室温放置2 h，1 000 r/min离心20 min，取上清液,按照ELISA法进行TpP浓度测定。加样时设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 ℃反应120 min。弃去液体，甩干。每孔加生物素标记抗体工作液 100 μL(取1 μL生物素标记抗体加99 μL生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前1 h内配制)，37 ℃反应60 min。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/每孔，甩干。 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100 μL，37 ℃反应60 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色，30 min内如肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔梯度不明显，即可终止。依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。在加终止液后15 min用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

1.5 TTC染色 心脏取血后，断头处死SD大鼠，取脑。去除嗅球、小脑和低位脑干，-20 ℃冷冻20 min，第一刀从脑前极与视交叉连线中点处取冠状面开始切片，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间，以保证均匀切成5片，每片约2 mm厚。脑片置于2%TTC液中，37 ℃避光温箱中放置30 min，再将脑片置10%福尔马林溶液中固定。

1.6 脑梗死面积百分比测定 缺血后，梗死区域的神经细胞缺血坏死，还原性辅酶Ⅱ(NADPH)丧失，不能将TTC还原，该区域脑组织呈灰白色；而正常脑组织内NADPH还存在，将氧化型TTC还原为还原型，该区域呈现红色，从而可区分梗死区与正常区。用眼科镊分离苍白区(梗死区)和非苍白区(正常区)，利用ImageJ2X图像分析软件计算脑梗死面积百分比。计算公式：梗死百分比(%)=苍白区面积/(苍白区面积+非苍白区面积)×100%。

1.7 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑梗死面积比较 手术6 h后，模型组、纤溶酶低剂量组、纤溶酶中剂量组、纤溶酶高剂量组脑梗死面积百分比分别为(30.75±6.23)%,(13.12±5.26)%,(10.60±4.01)%和(5.31±2.53)%。纤溶酶低剂量组、纤溶酶中剂量组、纤溶酶高剂量组脑梗死面积百分比均明显低于模型组(P均<0.01)。纤溶酶中剂量组和纤溶酶低剂量组脑梗死面积百分比差异无统计学意义(P>0.05)。纤溶酶高剂量组脑梗死面积百分比明显低于纤溶酶低剂量组(P<0.05)。

2.2 各组大鼠TpP水平比较 手术6 h后假手术组、模型组、纤溶酶低剂量组、纤溶酶中剂量组、纤溶酶高剂量组TpP水平分别为(5.34±1.22)μL/mL，(46.09±10.52)μL/mL，(29.10±6.31)μL/mL，(23.96±4.25)μL/mL，(12.33±4.02)μL/mL。模型组TpP水平明显高于假手术组(P<0.05)；纤溶酶低、中、高剂量组TpP水平均明显低于模型组(P均<0.05)，纤溶酶中剂量组与纤溶酶低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，纤溶酶高剂量组TpP水平明显低于纤溶酶低、中剂量组(P均<0.05)。

3 讨 论

血栓形成有3大原因：内皮损伤、血流减慢以及血液成分改变。正常大鼠内皮既不会损伤，血流也不会减慢，因此本研究采用改变血液成分方法，从颈外动脉注射凝血酶，促进大鼠体内凝血，在注射凝血酶前，回抽少量血液形成血栓，血栓在凝血酶前进入血管，减缓血流速度促进血栓形成，并且注射后还通过夹闭双侧颈总动脉以最大限度阻止血流对凝血酶的稀释；此外，还结扎了左侧颈外动脉与翼腭动脉，使颈内动脉成为颈总动脉唯一供血血管，从而保证血栓全部进入脑循环，以最大化造成脑组织梗死，同时，以这种方法可以进一步减少血栓栓子流入颈外动脉或翼腭动脉，避免造成实验误差。

本研究TTC染色结果显示，模型组大鼠灰质、白质均有明显的白色区域，证实造模引起大鼠严重脑梗死，梗死面积达30%；纤溶酶呈剂量依赖性的降低大鼠脑梗死面积，也证实了纤溶酶可有效治疗缺血性脑梗死，这与尹俊雄等[10]、王建等[11]的结论一致。

TpP是一种可溶性纤维蛋白多聚体，作为不溶性血栓的直接前体，是纤维蛋白原形成纤维蛋白的必经阶段。纤维蛋白原由2个亚基组成，亚基由α、β、γ 3条肽链组成，纤维蛋白原两端结构域称为D区，中间结构域称为E区[12]。在凝血酶作用下，纤维蛋白原2条α链、β链氨基末端发生裂解，释放出一对纤维蛋白肽A和一对纤维蛋白肽B,形成纤维蛋白单体。纤维蛋白礁A和纤维蛋白肽β的释放会暴露中央区的聚合部位，这样两个纤维蛋白单体发生非共价结合形成不稳定的复台物。第三个纤维蛋白单体加入后能以同样方式与其中之一单体相连，如此纤维蛋白单体通过分子间E-D区和D-D区的相互作用可形成双股的初纤维。当初纤维不断交联达到一定分子数量时，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单聚体，即TpP，又称可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)[13]。TpP在凝血因子XⅢ和钙离子作用下，相邻分子之间的Gln与Lys之间形成共价键，并在纤维网表面结合α2-抗纤溶酶，纤维蛋白凝块的黏度弹性大为增强，从而形成坚固的不可溶的交联纤维蛋白凝块。

TpP是纤维蛋白原经凝血酶作用而活化的产物，是血栓形成的最后门户，是血栓形成过程中的一种重要标志物，降低TpP水平可以直接抑制活动性血栓的形成，防治梗死的发生。然而，人们在19世纪60年代才注意到TpP的存在，直到1978年，人们清楚地了解了纤维蛋白原形成血栓的过程变化，才真正认识了TpP的真正含义以及它的分子组成[14]。由于纤维蛋白原的异质性而包含了数百万种异构体，并且纤维蛋白原的低抗原性更使得开发纤维蛋白原抗体难度大大提高，至今仍未有一个精确地测量TpP浓度方法[15]。由于TpP的特殊意义，人们开始了TpP抗体的开发。Hamano等[16]研究发现一可识别在TpP C端区域的单克隆抗体，不仅可同纤维蛋白原及其降解产物区分，也可同TpP降解产物X’、Y’、E’片段区分，大大提高了TpP检测的准确性，但遗憾的是该抗体仍未能大范围应用于实验室检验中。本实验中所选试剂盒仍可能因TpP降解产物片段的影响而造成结果的偏差。

本研究结果显示，模型组大鼠TpP水平显著升高，达到正常水平的9～10倍；纤溶酶呈剂量依赖性降低大鼠血浆TpP水平，纤溶酶高剂量组几乎恢复至正常水平，这与脑梗死面积变化趋势一致，说明纤溶酶通过降低TpP水平防止大鼠缺血性脑梗死，为血栓性疾病的诊断和治疗提供了新的理论依据，但对于纤溶酶降解TpP的具体机制有待进一步研究。

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Preventive effect of fibrinogenase on experimental cerebral infarction and the influence on plasma thrombus precursor protein

LIANG Xiaoling, WANG Shibin

(Taiyuan Medicinal Materials Supply Station of the Beijing Military Area Command of PLA, Taiyuan 030012, Shanxi, China)

Objective It is to observe the preventive effect of fibrinogenase on experimental cerebral infarction and the influence on the level of plasma thrombus precursor protein (TpP). Methods 50 SD rats were divided into sham-operation group, model group, and Low, Middle and High dose of fibrinogenase group with 10 rats in each; in which pre-operative treatment for 30 min, a single iv dose of 1, 2 and 4 IU/10 g of fibrinogenase was given for the three groups (Low dose group, Middle dose group, High dose group) respectively, and sham-operation group and model group were given normal saline as same capacity. At 6-hour after operation, the blood and brain were taken to measure the infarct area and the concentration of TpP. Results The percentage of cerebral infarction area of Low, Middle and High dose of fibrinogenase group was (13.12±5.26)%, (10.60±4.01)% and (5.31±2.53)% respectively, and for model group was (30.75±6.23)%. The concentration of TpP Low, Middle and High dose of fibrinogenase group was (29.10±6.31)μg/mL, (23.96±4.25)μg/mL and (12.33±4.02)μg/mL, for model group was (46.09±10.52)μg/mL. The percentage of cerebral infarction area and the levels of TpP of Low, Middle and High does of fibrinogenase group were significantly lower than those of model group (allP<0.05), and the percentage of cerebral infarction area of High does of fibrinogenase group was markedly lower than that of Low does of fibrinogenase group (P<0.05), and the TpP concentration was markedly lower than those of Middle and Low does of fibrinogenase group (allP<0.05). Conclusion Fibrinogenase has a preventive effect on cerebral infarction and can reduce the TpP concentration in blood.

fibrinogenase; thrombus precursor protein; fibrinogen; cerebral infarction

梁晓玲，女，主管技师，研究方向为心脑血管药物、药理的研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.007

R-332

A

1008-8849(2015)12-1273-03

2014-11-19