癫痫发病中Rnd1-2蛋白的表达情况及意义

戴永建

(湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000)

癫痫发病中Rnd1-2蛋白的表达情况及意义

戴永建

(湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000)

目的 探讨Rnd1-2蛋白在癫痫患者脑组织中的表达情况。方法 选择癫痫手术患者36例作为研究组，同时选取12例颅脑创伤患者作为对照组。应用免疫荧光、免疫组化以及Western-blot法检测2组脑组织中Rnd1-2蛋白表达情况。结果 研究组颞叶脑组织中Rnd1-2蛋白的平均灰度显著低于对照组(P<0.05)，阳性细胞数、光密度值均显著高于对照组(P均<0.05)；免疫荧光检测显示，研究组Rnd1-2蛋白的阳性表达区域同神经元特异性烯醇化酶阳性区域基本重叠。结论 Rnd1-2蛋白表达集中于神经元，在癫痫的形成过程中有重要作用，对Rnd1-2蛋白的研究有助于阐明癫痫发病机制，有应用及推广价值。

Rnd1-2蛋白；癫痫；脑组织

国际抗癫痫联盟定义部分丘脑、上位脑干灰质神经元、皮质、深部核团突然性发作或者短暂异常放电，从而导致患者脑功能紊乱的现象为癫痫[1-2]。当前国内将癫痫定义为病因复杂，脑部神经元发生异常放电现象，且具有高度同步化、反复发作、短暂性等特点，属于中枢神经系统功能紊乱性综合征。患者具体的临床表现为运动、感觉、意识、情感、自主神经、精神、认知以及记忆紊乱[3-4]，出现反复性的癫痫发作。特定的体征以及症状表现又被称之为癫痫综合征。突触重构即神经网络的重建是癫痫的主要发病机制之一。在中枢神经的网络重建中，Rho家族中Cdc42与Rac均起着积极的正性作用，并在突触、生长锥以及发芽的形成中起到了十分积极的作用[5-6]。Rho家族属于小分子GTP黏附蛋白，作为其亚家族，Rnd蛋白家族主要包括了Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rnd6等，其中Rnd1-2蛋白参与了神经网络重建，且发挥着十分重要的作用。为了进一步了解在癫痫的形成过程中Rnd1-2蛋白所起的作用，笔者检测了36例癫痫手术患者及12例颅脑创伤患者脑组织中Rnd1-2蛋白表达情况，旨在探讨其在癫痫发病机制中的作用，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2012年3月—2014年5月在本院行手术治疗的36例癫痫患者作为研究组，男22例，女14例；年龄(29.4±9.2)岁。患者均符合癫痫诊断标准，且均具有典型的脑电图特征以及临床表现，患者一般使用过卡马西平、苯妥英钠等抗癫痫药物治疗，经检查发现血浓度为正常高限，患者治疗后发作频率未见显著性减少；患者可寻病因不够明显，未见与癫痫有关的神经功能缺损体征，经详细的病理检查术后脑组织未见可引发癫痫发作的具体病因；经脑MRI、CT检查发现海马硬化，但未见其他异常现象；在术前通过硬膜下电极监测，可见固定或者明确的癫痫放电部位，且手术适应证明显可进行手术治疗；患者或者家属对病情有所了解并同意签署知情书。排除同时患有进行性神经性疾病者，患有对治疗有严重影响的急慢性疾病者，有精神病病史者，存在药物或者乙醇滥用史者，患者本人或者家属不同意者。另选择同期收治颅脑创伤患者12例作为对照组，男7例，女5例；年龄(31.5±10.2)岁；均行减压术。患者均无家族遗传病史，无癫痫史或者其他神经系统疾病史，经病理切片研究证实脑组织结构均正常，且无明显的低氧缺血损害表现，家属均同意且签署知情书。

1.2 检测方法 取2组患者颞叶脑组织进行Rnd1-2检测。

1.2.1 免疫组化检测 对组织切片行脱蜡抗原热修复处理，将收集到的血清封闭液进行封闭，加入USCN公司的兔抗人Rnd1-2蛋白多克隆一抗，4 ℃孵育过夜，经DAB显色处理，并应用苏木精复染，最后使用中性树脂进行封固，若胞膜与胞质染成棕黄色则视为阳性。每例样本取10张切片，随机选取其中3张行免疫组化处理，在高倍镜下对每张切片随机选取10个视野计数对阳性细胞数；应用北航CM-2000B彩色病理分析系统测定平均灰度值。

1.2.2 双重免疫荧光检测 对组织切片行脱蜡抗原热修复处理，随后滴加1%的牛血清白蛋白，并加入0.4%Triton，于室温下放置约1 h，再用山羊血清封闭液进行封闭处理5 h，保证对特异性抗原进行充分封闭。随后加入Rnd1-2蛋白一抗及NSE工作液(北京中杉提供)4 ℃孵育过夜，再分别依次加入山羊抗兔二抗(绿色荧光标记，北京中杉提供)与山羊抗小鼠二抗(红色荧光标记，北京中杉提供)，均在室温下进行避光孵育1 h，最后经PBS充分冲洗后终止反应，经PBS混合液封固处理，使用共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2)观察结果。

1.2.3 Western-blot检测 取样品16 μL，随后加入上样缓冲液约4 μL，在沸水中将混匀后的样品煮约3 min使蛋白发生变性，再加入电泳液并准备上样；调整电泳，电压调至120 V，电泳处理至跑出溴酚蓝则即刻终止，然后取出膜，同时做好标记，需注意正反面，随后采用TBST进行清洗约1 min，最后使用封闭液封闭过夜，再使用封闭液将相应一抗稀释成一定浓度(1∶1 000),室温孵育1.5 h,TBST清洗3次，100 min/次，最后在暗室中将胶依发光强度选择曝光程度显影。

2 结 果

2.1 2组平均灰度及阳性细胞数比较 研究组颞叶脑组织中Rnd蛋白1-2的平均灰度值为127.63±6.24，对照组为173.76±3.82，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。研究组阳性细胞数(30.21±3.44)个，对照组(11.17±0.65)个，2组神经元细胞内均能够见到棕黄色的阳性颗粒，主要分布在细胞质与细胞膜中，同时发现研究组神经细胞轴突当中阳性颗粒聚集十分明显。见图1及图2。

图1 研究组颞叶脑组织Rnd1-2蛋白表达情况(×400)

图2 对照组颞叶脑组织Rnd1-2蛋白表达情况(×400)

2.2 双重免疫荧光检测结果 双重免疫荧光图片可见研究组患者脑组织中Rnd1-2(标记绿色)与NSE(标记红色)有共同表达，见图3～5；而在其他区域却少见Rnd1-2蛋白的单独阳性表达。

图3 Rnd1-2蛋白阳性表达情况

图4 NSE阳性表达情况

2.3 Western-blot检测结果 研究组Rnd1-2蛋白光密度比值为0.51±0.04，对照组为0.21±0.01，2组比较差异有统计学意义(t=3.902，P=0.003)。

3 讨 论

癫痫病理学异常多为组织出现局部性神经元丢失或者变性，甚至发生胶质化细胞的结节以及增生。患者的神经系统针对这种情况会做出神经突触重组的反应，重新所产生的一种反应神经元环路，但会刺激神经元，增加其兴奋性，该现象被称为癫痫芽生。在正常的神经网络当中，神经元之间需要靠多种联系方式来建立信号，尤其是依赖突触。在癫痫患者的神经网络当中，因为诸多因素，最终造成患者的神经突触发生了断裂，并引发了轴突芽生，进一步在多种分子的导向下，使轴突伸长并与新的神经突触重新建立突触关系，从而形成新的神经网络，导致癫痫的反复发作。癫痫的形成与以突触芽生为基础的神经网络重建有密切关系[7-8]。Rnd1-2蛋白在突触的生长与导向以及神经网络的形成中发挥了重要且积极的作用。Rnd1-2蛋白基因的编码位于12号染色体长臂q12-13，主要分布在大脑皮质与海马锥体细胞中；而神经细胞的亚细胞部位则主要集中Rnd1-2蛋白，多分布于细胞质与突触体膜中，Rnd1-2蛋白的激活也是经由表达水平提升来实现的。

图5 Rnd1-2及NSE共同表达区域

本研究发现癫痫患者的颞叶脑组织Rnd1-2蛋白表达有所上调，神经细胞中呈现褐色的Rnd1-2蛋白阳性区域主要就分布在细胞膜与细胞膜附近，而对照组中阳性表达则不具有这样明显的趋势，由此说明不同亚细胞部位的滞留现象可能是Rnd1-2蛋白最终实现其激活的一种方式，这与目前一些动物模型研究相吻合[9-10]。这些研究均表明Rnd1-2蛋白存在一个向细胞膜转移的激活程序。为了能更好地了解癫痫脑组织细胞分布情况，笔者又进行了双重免疫荧光检测，结果发现Rnd1-2蛋白与NSE有共同表达，但其他的区域却很少发现Rnd1-2蛋白的单独阳性表达。由于NSE的特异性表达主要在神经元，可见Rnd1-2蛋白也主要表达于神经细胞。

生长锥在神经网络的重建中对轴突与树突的生长与方向起着决定作用，而生长锥功能出现异常，很可能是癫痫发生及发展的重要环节[11]。Burneo等[12]研究证实了Rnd1-2蛋白可以与Plexin-A1与Plexin-B1作用，并将轴突导向的一个排斥因子(Semaphorins)信号所转导。此外，Rnd1-2蛋白信号途径会通过对树突棘产生刺激而导致异常网络的形成，这与上述观点基本一致。

综上所述，癫痫患者的颞叶脑组织中可见Rnd1-2蛋白表达上调，耐药癫痫患者的神经异常网络形成是最为显著的病理改变，而Rnd1-2蛋白通过对生长锥的调节并最终参与了癫痫异常神经网络的形成过程，并在癫痫的发病机制中起到了作用，通过对Rnd1-2蛋白进行调控，可能成为新的抗癫痫治疗靶点。

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Study on the significance and expression of Rnd protein 1-2 in epilepsy

DAI Yongjian

(The People’s Hospital Affiliated to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to investigate the expression of Rnd protein 1-2 in the brain tissue of patients with epilepsy. Methods 36 cases of epilepsy patients were selected for study group, and 12 cases of of cerebral trauma patients as control group, the expression of Rnd protein 1-2 in brain tissue were detected by immunofluorescence, immunohistochemistry and Western-blot method in both groups. Results The average gray worth of temporal lobe brain tissue was (127.63±6.24) in study group and was (173.76±3.82) in control group, there was significant difference between both groups (P<0.05). The number of positive cells was (30.21±3.44) in study group and was (11.17±0.65) in control group, the optical density value was (0.51±0.04) in study group and was (0.21±0.01) in control group, there were significant differences between both groups (P<0.05). Immunofluorescent assay showed that the regional of positive expression of Rnd protein 1-2 and the positive regional of neural asexual enolase specific namely NSE was basic overlap in study group.Conclusion The expression of Rnd protein 1-2 is mainly focus on neurons, it play an important role in the formation of epilepsy. The study on Rnd protein 1-2 is contributed to elucidate the pathogenesis of epilepsy; it has the value of application and popularization.

Rnd protein 1-2; epilepsy; brain tissue

戴永建，男，主治医师，研究方向为癫痫的发病机制及外科治疗。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.003

R749.17

A

1008-8849(2015)12-1261-03

2014-10-15