幽门螺杆菌感染性胃癌组织中Legumain、MMP-9的表达及其临床意义

汤新跃

(广东省第二人民医院,广东 广州 510317)

幽门螺杆菌感染性胃癌组织中Legumain、MMP-9的表达及其临床意义

汤新跃

(广东省第二人民医院,广东 广州 510317)

目的 探讨幽门螺杆菌(H.pylori)感染性胃癌组织中半胱氨酸蛋白酶(Legumain)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达情况及其临床意义。方法 选取手术切除胃癌组织标本109例，采用Warthin-Starry银染色法检测H.pylori感染情况，根据其H.pylori感染情况分为H.pylori阳性组59例和H.pylori阴性组50例，同时选取癌旁正常胃组织标本55例作为对照组，采用免疫组化方法检测各组Legumain、MMP-9表达情况。结果 胃癌组织Legumain阳性率、MMP9阳性率均明显高于对照组(P均<0.05)。H.pylori阳性组Legumain、MMP-9表达均与患者性别、组织分化程度、临床分期和淋巴结转移相关；其中男性、组织学分化程度越低、临床分期越高及合并淋巴结转移患者Legumain阳性表达率、MMP-9阳性表达率均明显高于H.pylori阴性组(P均<0.05)；Legumain、MMP-9阳性表达率越高；经Pearson相关性分析发现：胃癌组织Legumain与MMP-9表达呈正相关(r=0.46，P<0.05)。结论 胃癌组织Legumain、MMP-9呈过度表达，其中H.pylori感染性胃癌组织Legumain、MMP-9阳性表达更显著，且两者表达与胃癌病情发生与发展密切相关，H.pylori感染可作为胃癌发生和发展的独立危险因素之一。

胃癌；幽门螺菌感染；Legumain；MMP-9

幽门螺杆菌感染(H.pylori)在慢性胃炎、胃溃疡、不典型增生、癌前病变和胃癌的发生和发展中发挥着重要的作用。半胱氨酸蛋白酶(Legumain)在结肠癌、乳腺癌等多数恶性肿瘤组织中呈过表达，Legumain的表达在癌症患者的临床预后中具有重要的意义，在恶性肿瘤发生和发展中发挥重要作用[1]。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)可促进肿瘤血管形成和细胞外基质降解，而二者在恶性肿瘤转移浸润中具有重要的临床意义[2]。但关于MMP-9、Legumain在H.pylori感染性胃癌组织中的表达及其意义的研究较少。故本研究探讨了Legumain、MMP-9在H.pylori感染性胃癌组织中的表达情况及其意义，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集我院2011年1月—2012年6月手术切除胃癌组织标本109例和距胃癌组织边缘>5 cm的癌旁正常胃组织55例(对照组)，全部患者的临床资料均来自院内病历档案记录，术前未经放疗、化疗和免疫治疗等辅助治疗，术后经病理组织检查符合胃癌的诊断标准[3]。109例胃癌患者男75例，女34例；年龄35～88(63.87±12.02)岁；组织高分化22例，中分化45例，低分化42例，TNM临床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期36例，Ⅲ期42例，Ⅳ期19例；根据H.pylori感染情况(Warthin-Starry银染色法测定)分为2组:H.pylori阳性组59例，男42例，女17例;年龄(64.07±13.01)岁；组织高分化12例，中分化25例，低分化22例；TNM临床分期：Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期31例。H.pylori阴性组50例，男33例，女17例；年龄(62.99±12.87)岁；组织高分化10例，中分化20例，低分化20例；TNM临床分期：Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期30例。对照组55例，男35例，女20例；年龄(61.54±10.34)岁；3组在性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准和研究对象的知情同意。

1.2 方法 全部组织标本经4%甲醛固定，石蜡常规包埋，连续行4 μm厚度的组织切片，组织切片脱蜡脱水后给予pH6.0，0.01 mmol/L枸橼酸钠微波2 min，以达到抗原修复之目的。采用3%双氧水常温下孵育10 min，降低过氧化物酶活性，5%牛血清白蛋白常温封闭1 h，滴加小鼠抗人Legumain单克隆抗体(1∶50,购自Santa Cruz公司)或兔抗人MMP-9多克隆抗体(1∶50,,购自Santa Cruz公司)，滴加PBS缓冲液作为阴性对照，低温环境下孵育过夜，再滴加HRP(Horseradish Peroxidase)标记羊抗小鼠二抗(购自Santa Cruz公司)，室温环境孵育1 h，DAB(3，3-diaminobenzidine)显色剂(显色剂盒购自北京康威生物公司)显色，HE复染后脱水透明，树胶封片。

1.3 阳性结果判定标准 Legumain、MMP-9阳性表达以细胞质内棕黄色颗粒为标准，随机选取3个高倍镜视野下细胞数目和阳性细胞数目，计算阳性细胞数/细胞数目的比值。比值≥50%为Legumain阳性，<50%为Legumain阴性；比值≥30%为MMP-9阳性，<30%为MMP-9阴性。

2 结 果

2.1 各组Legumain、MMP-9表达情况 H.pylori阳性组Legumain和MMP-9阳性表达率明显高于H.pylori阴性组和对照组(P均<0.05)，H.pylori阴性组明显高于对照组(P均<0.05)，见表1。Legumain、MMP-9在胃癌组织中免疫组化检测表达情况见图1和图2。

表1 3组Legumain、MMP-9表达情况 例(%)

注：①与对照组比较，P<0.05;②与H.pylori阴性组比较，P<0.05。

图1 胃癌组织Legumain表达的情况(×400)

图2 胃癌组织MMP-9表达情况(×400)

2.2 Legumain、MMP-9的表达与临床相关因素分析 胃癌组织Legumain阳性率为64.22%(70/109)，胃癌组织MMP-9阳性率为86.24%(94/109)。Legumain、MMP-9的表达与患者的性别、组织分化程度、临床分期和淋巴结转移有关，表现为男性、组织分化程度越低、临床分期越高及合并淋巴结转移者胃癌组织Legumain、MMP9阳性表达率越高，见表2。

2.3 胃癌组织Legumain与MMP-9表达的关系 胃癌组织Legumain与MMP-9表达呈正相关(r=0.46，P<0.05)，见表3。

3 讨 论

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其中我国胃癌发生呈明显年轻化倾向。胃癌病死率高，临床预后差，主要与胃癌的转移、侵袭相关。进展期胃癌的生长较快，临床发现的胃癌患者多处于中晚期，此类患者的远期生存率极低。随着对H.pylori的深入研究发现，H.pylori在不利于自身生长的胃液中引起细胞壁缺陷，增加对宿主细胞的黏附能力，避免对机体免疫攻击，在人体内长期存在并导致胃黏膜的慢性损伤，甚至形成持续性炎症性反应，增加胃部恶性肿瘤的发生[4]。Wang等[5]报道，H.pylori感染性胃癌的检出率明显高于H.pylori 感染性胃部良性病变，提示H.pylori在机体内长期生长可能与胃癌的发生和发展密切相关。于金林等[6]研究亦表明，H.pylori通过长期对胃黏膜细胞DNA破坏加重了胃癌的病情程度，且长期存在的H.pylori相关性感染加重了胃黏膜炎症，使上皮细胞增生能力明显增强，甚至出现不典型增生等癌前病变预兆[6]。因此，H.pylori在胃癌的发生和发展中具有重要意义。

表2 Legumain、MMP-9的表达与临床病理因素关系

表3 胃癌组织Legumain与MMP-9表达的关系 例

MMP-9是MMP家族中分子质量较大的细胞基质金属蛋白酶，活性MMP-9具有产生胶原酶的功能，可破坏肿瘤及其肿瘤附近的胶原蛋白，促进肿瘤细胞向缺乏基底膜的周围组织转移、浸润，促进了肿瘤的进展[7-8]。同时其可促进肿瘤新生血管形成，加重肿瘤细胞的生长繁殖，加重疾病的病情程度[9]。Legumain是由肿瘤细胞及其巨噬细胞表达，在多数肿瘤中呈阳性表达，但在正常组织中呈低表达，提示Legumain在肿瘤的发生和发展中具有重要的临床意义[10-11]。Legumain本质是蛋白酶，其中通过直接或间接作用于MMP-9，将MMP-9无活性蛋白酶形式逐渐向具有降低细胞外基质活性的MMP-9形式转变，从而发挥增加肿瘤转移程度的生物作用[12]。因此，在Legumain因子的靶向抗肿瘤细胞治疗中，通过去除肿瘤细胞中的Legumain可有效降低肿瘤细胞生长繁殖及其侵袭转移能力[18]。

本研究结果显示，胃癌组织Legumain和MMP-9阳性率均明显高于癌旁正常胃黏膜组织，其中H.pylori阳性胃癌组织二者阳性表达率明显高于H.pylori阴性胃癌组织，提示Legumain、MMP-9在H.pylori感染性胃癌组织中呈高表达，且明显高于H.pylori阴性胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织。Legumain、MMP-9表达均与患者性别、组织分化程度、临床分期和淋巴结转移相关，表现为男性患者、组织分化程度越低、临床分期越高及有淋巴结转移的胃癌组织Legumain、MMP-9阳性表达率越高，提示胃癌越严重，两者表达程度越高，与文献[14-15]报道结果相一致；经进一步Pearson相关性分析还发现，胃癌组织Legumain与MMP-9表达呈正相关，证实两者均可促进胃癌组织的生长，促进胃癌细胞的转移和浸润。因此，H.pylori感染性胃癌组织的Legumain、MMP-9的阳性表达率更高，在预测胃癌病情的严重程度中具有重要的意义。

综上所述，胃癌组织Legumain、MMP-9呈过度表达，其中H.pylori感染性胃癌组织Legumain、MMP-9阳性表达更显著，且两者表达与胃癌病情发生与发展密切相关，H.pylroi感染可作为胃癌发生和发展的独立危险因素之一。

[1] 冯倩，刘杞，向荣，等. Legumain 在胃癌中的表达及其临床意义[J]. 第三军医大学学报，2014，36(3)：232-235

[2] 欧玉荣，康敏，周蕾，等. 胃癌中幽门螺杆菌L型感染与MIF、MMP9、VEGF表达的关系[J]. 南方医科大学学报，2014，34(2):180-187

[3] Ali Z，Deng Y，Ma C. Progress of research in gastric cancer[J]. J Nanosci Nanotechnol，2012，12(11)：8241-8248

[4] 杜美林，王小玲，樊建平，等. 胃癌及癌前病变中幽门螺杆菌感染与分泌型卷曲相关蛋白基因启动子甲基化的关系研究[J]. 中国全科医学，2013，16(36)：4272-4275

[5] Wang L，Chen S，Zhang M，et al. Legumain: a biomarker for diagnosis and prognosis of human ovarian cancer[J]. J Cell Biochem，2012，113(8)：2679-2686

[6] 于金林，孟卫东，初瑞雪. 幽门螺杆菌感染和p53表达与胃癌及胃癌前病变关系的临床研究[J]. 中国当代医药，2014，21(2)：38-39；42

[7] 彭金珍，韦春回，石磊，等. 三叶因子3和基质金属蛋白酶-9在胃癌中的表达及意义[J]. 实用医学杂志，2013，29(24)：4020-4022

[8] 李迪胜，邓香山，程峰，等. 幽门螺杆菌感染与胃癌侵袭转移及COX-2和MMP-9表达的关系[J]. 现代生物医学进展，2010，33(7)：1319-1321

[9] 许杰. 胃腺癌中小凹蛋白、基质金属蛋白酶-9和转移相关蛋白-2表达的关系[J]. 中国老年学杂志，2014，34(4)：1102-1103

[10] Teng L，Wada H，Zhang S. Identification and functional characterization of legumain in amphioxus Branchiostoma belcheri[J]. Biosci Rep，2009，30(3)：177-186

[11] Dall E，Brandstetter H. Mechanistic and structural studies on legumain explain its zymogenicity, distinct activation pathways, and regulation[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2013， 110(27)：10940-10945

[12]SmithR,JohansenHT,NilsenH,etal.Intra-andextracellularregu lationofactivityandprocessingoflegumainbycystatinE/M[J].Biochimie,2012,94(12):2590-2599

[13] Yoshio Ohno,Jun Nakashima,Makoto Ohori,et al. 682 association of the legumain expression pattern with prostate cancer invasiveness and aggressiveness[J]. The Journal of Urology,2010,183(4):266

[14] 李晓珊,徐庆,傅向阳，等. 基质金属蛋白酶-9在胃癌中的表达及其预后价值[J]. 临床肿瘤学杂志,2014,32(9):804-808

[15] 赵远,王永忠. 胃癌组织中E-cadherin和MMP-2、MMP-9的表达及临床意义[J]. 江苏医药,2013,39(9):1034-1036

The express of Legumain, MMP9 in Helicobacter pylori infective gastric carcinoma tissue and its clinical significance

TANG Xinyue

(Guangdong NO.2 Provincial People’s Hospital, Guangzhou 510317, Guangdong, China)

Objective It is to observe the express of Legumain, MMP9 of Helicobacter pylori infective gastric cancer, and analyze the clinical significance. Methods 109 cases of gastric cancer tissue were collected to detect Helicobacter pylori (H.pylori) infection by Warthin-Starry silver staining method, and were divided into H.pylori positive group (n=59) and H.pylori positive group (n=50) according to H.pylori infection. 55 cases of normal gastric tissue were selected as control group at the same time. The expressions of Legumain, MMP9 were detected by immunohistochemistry for all cases. Results The positive expression rate of Legumain and MMP-9 in gastric cancer tissue were significantly higher than that of control group (allP<0.05), while the positive expression rate of Legumain and MMP-9 in H.pylori positive group were significantly higher than those in H.pylori negative group (allP<0.05). The expression of Legumain and MMP-9 were associated with gender, histological differentiation, clinical stage and lymph node metastasis, which of Male, histological differentiation degree of lower, clinical stage of higher and lymph node metastasis with higher positive expression rate of Legumain and MMP-9. Pearson correlation analysis showed that the Legumain express in gastric cancer was positively correlated with MMP-9 express in gastric cancer (r=0.46,P<0.05). Conclusion Legumain, MMP-9 are highly express in gastric cancer, and both positive express are higher in H.pylori infective gastric cancer, and are closely related to the occurrence and development of gastric cancer. H.pylori infection can be used as one of the independent risk factors for the occurrence and development of gastric cancer.

gastric cancer; helicobacter pylori; Legumain; MMP-9

汤新跃，男，主治医师，主要从事临床常见、多发肿瘤的综合诊治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.006

R735.2

A

1008-8849(2015)12-1270-04

2014-12-25