肠益煎对裸鼠结肠癌移植瘤抑瘤作用的实验研究

吴婷婷,王燕莹,钟 薏,张士强,曹晟丞,张海盛

(1. 上海中医药大学附属上海市中西医结合医院,上海 200080；2. 山东省淄博市中西医结合医院，山东 淄博 255000；3. 上海市松江区方塔中医医院，上海 201600)

肠益煎对裸鼠结肠癌移植瘤抑瘤作用的实验研究

吴婷婷1,王燕莹2,钟 薏1,张士强1,曹晟丞3,张海盛3

(1. 上海中医药大学附属上海市中西医结合医院,上海 200080；2. 山东省淄博市中西医结合医院，山东 淄博 255000；3. 上海市松江区方塔中医医院，上海 201600)

目的 探究肠益煎对移植性结肠癌裸鼠肿瘤的抑制作用。方法 将接种人结肠癌LOVO细胞悬液于裸鼠皮下成功制备的裸鼠移植性结肠癌模型60只随机分为模型组(A组)、肠益煎组(B组)、5-氟尿嘧啶组(C组)、5-氟尿嘧啶+奥沙利铂组(D组)、肠益煎+5-氟尿嘧啶组(E组)、肠益煎+5-氟尿嘧啶+奥沙利铂组(F组)，每组10只，模拟临床给药。A组给予生理盐水20 mL/(kg·d)灌胃；其他组中肠益煎采用水煎剂12.5 g/(kg·d)灌胃，均每天1次，共14 d；5-氟尿嘧啶及奥沙利铂采用腹腔注射，隔天1次，共5次。疗程中观察并记录裸鼠体质量。疗程结束后 处死裸鼠，采集标本，记录瘤质量，计算肿瘤指数和抑瘤率。结果 裸鼠去瘤后质量B、C、D、E、F组均显著高于A组(P均<0.05)，D、E、F组均显著高于B、C组(P均<0.05)，D、E、F组间比较差异均无统计学意义；C、D、E、F组裸鼠瘤质量、肿瘤指数明显低于A、B组(P均<0.05)，D、F组明显低于C组(P均<0.05)。C、D、E、F组抑瘤率均明显高于B组(P均<0.05),D、F组明显高于C组(P均<0.05)。结论 中药复方肠益煎可以稳定患瘤裸鼠体质量，有一定的抑制肿瘤瘤体生长作用，联合化疗药物5-氟尿嘧啶、奥沙利铂抑瘤效果更佳。

肠益煎;肠癌;肿瘤指数;抑瘤率;裸鼠

大肠癌是世界第4位的恶性肿瘤[1]，目前主要治疗方式为手术切除，而手术后的高复发转移率一直是近年来大肠癌治疗的瓶颈，故降低术后复发转移非常重要。5-氟尿嘧啶和奥沙利铂是大肠癌根治术后广泛应用的化疗药物，而中药复方具有降低化疗的毒副反应、影响细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、改善免疫功能、多靶点综合治疗等作用。本实验建立人结肠癌LOVO细胞的皮下移植瘤模型，旨在观察中药肠益煎及肠益煎联用化疗药物对肿瘤的抑制作用，为其临床应用提供依据。

1 实验资料

1.1 实验动物 4～5周龄BALB/c雌性裸鼠60只，体质量20～24 g，由中科院上海斯莱克实验动物有限公司提供，于无特定病原体(SPF)环境饲养。实验动物合格证号：SCXK(沪)2009-0069。

1.2 肿瘤细胞株 人结肠癌细胞LOVO细胞，由上海中科院提供。

1.3 实验药物 中药复方肠益煎由党参、茯苓、白术、土茯苓、菝葜、八月札、鸡内金、陈皮等组成，由上海中医药大学附属曙光医院中药房提供。1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、HEPES(GIBCO)；DAB 、EDTA(Sigma)；MTT试剂盒(碧云天生物科技有限公司)。5-氟尿嘧啶注射液(5-Fu,上海旭东海普药业有限公司,批号：FA120912，规格：250 mg/支)。奥沙利铂注射液(L-OHP，江苏恒瑞药业有限公司，批号：11112711，规格：250 mg/支)。

1.4 仪器 超净工作台(Bio-Hazard型，造鑫企业有限公司)；CO2细胞培养箱(B5060EK/CO2，德国Heraeus)；倒置显微镜(上海光学仪器厂)；4 ℃冰箱(得贝FF40，青岛电冰箱厂)；低温冰箱(MDF-292，SANYO CO。)；高压蒸气消毒器(上海医用核子仪器厂)；电子分析天平(上海天平仪器厂)。

1.5 实验方法

1.5.1 裸鼠移植瘤模型的建立 人结肠癌LOVO细胞，使用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素的1640培养基，培养于37 ℃含5%CO2培养箱中，细胞贴壁生长，至70%～80%融合时采用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA液消化传代，调整细胞数为1.25×1010L-1，每只裸鼠皮肤消毒后以1 mL注射器于左下肢皮下注射0.2 mL细胞悬液，接种细胞2×106个/只，共60只。

1.5.2 分组与干预方法 待移植瘤平均直径约5 mm后(细胞种植后第16天)，将全部裸鼠以随机数字表法分为模型组(A组)、肠益煎组(B组)、5-氟尿嘧啶组(C组)、5-氟尿嘧啶+奥沙利铂组(D组)、肠益煎+5-氟尿嘧啶组(E组)、肠益煎+5-氟尿嘧啶+奥沙利铂组(F组)，每组10只。肠益煎采用水煎剂12.5 g/(kg·d)灌注，共14 d；5-氟尿嘧啶及奥沙利铂剂量参照成人体表面积换算，药物剂量换算公式：dB=dA×(RB/RA) ×(WA/WB)1/3，采用腹腔注射，隔天1次，共5次。A组给予等量的生理盐水灌胃14 d，0.2 mL/10 g。第16天处死裸鼠。

1.6 检测指标 给药前及给药后第5天、第9天、第13天观察并记录裸鼠体质量。第16天处死裸鼠，采集标本，记录瘤质量，计算肿瘤指数(肿瘤指数=瘤质量/去瘤后鼠质量)、抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-治疗组平均瘤质量/模型组平均瘤质量)×100%。

2 结 果

2.1 各组体质量比较 裸鼠去瘤后，B、C、D、E、F组体质量均显著高于A组(P均<0.05)，D、E、F组显著高于B、C组(P均<0.05)。给药第5天，D、E、F组体质量显著高于A组(P均<0.05)，B、C组显著高于D组(P均<0.05)；第9天，D、E、F组明显高于A、B组(P均<0.05)，D组高于C组(P<0.05)；第13天，D、E、F组明显高于A、C组(P均<0.05)，D组高于B组(P<0.05)。见表1。

表1 各组裸鼠体质量、去瘤后体质量比较

注：①与A组比较，P<0.05；②与B相比较，P<0.05；③与C组比较，P<0.05。

2.2 各组瘤质量、肿瘤指数及抑瘤率比较 C、D、E、F组裸鼠瘤质量、肿瘤指数均明显低于与A、B组(P均<0.01)；D、F组明显低于C组(P均<0.05)。C、D、E、F组抑瘤率均明显高于B组(P均>0.05),D、F组明显高于C组(P均<0.05)。见表2。

注：①与A组比较，P<0.05;②与B组比较，P<0.05;③与C组比较，P<0.05。

3 讨 论

随着人民生活水平的提高，结直肠癌的发病率正在大幅提高。目前，手术切除为大肠癌的根治性治疗措施，但50%大肠癌患者于手术根治后2年内可出现复发或转移[2]，术后3年复发转移率高达95%[3]，这成为影响肠癌患者术后生存率的至关重要的因素。

历代医家就肠癌病机和治疗多有阐发，《灵枢·五变》云：“人之善病肠中积聚者……皮肤薄而不泽，肉不坚而淖泽，如此则肠胃恶，恶则邪气留止，积聚乃伤。”肠癌术后，患者正气已虚，脾失健运，水谷不化，气血乏源，湿浊壅滞，久而化热，湿热内蕴。中医中药治疗以扶正为本，兼施以清热化湿。中药复方是以中医药理论为基础，采用君臣佐使的复方配伍法则及灵活多样的炮制方法，具有毒副作用小、综合调节人体阴阳平衡等特点，能通过多靶点发挥抗肿瘤作用，逐渐为学界和大众所认可。杨静[4]使用健脾导滞法(党参、苍术、白术、猪苓、茯苓、薏苡仁、枳实、厚朴、黄柏、红藤、败酱草、虎杖、白花蛇舌草、炒谷芽、炒麦芽)联合化疗治疗晚期肠癌，发现中药联合化疗能改善患者症状、体力情况，提高患者的生活质量及免疫功能，减少患者感染的机会。张青等[5]将120例晚期大肠癌患者随机分成治疗组60例和对照组60例，治疗组采用固本消瘤胶囊联合FOLFOX4方案治疗，对照组仅采用FOLFOX4方案化疗，治疗4个周期后治疗组的临床受益率和1年生存率均明显高于对照组。蒋益兰等[6]研究发现健脾消癌饮(党参、白术、茯苓、黄芪、灵芝、薏苡仁、仙灵脾、丹参、白花蛇舌草、七叶一枝花、半枝莲、石见穿、莪术、法夏、广木香、炒枳壳)配合化疗能降低大肠癌术后的复发转移，延长生存期。可见，中医中药配合化疗已成为大肠癌术后重要的治疗方式。

肠益煎以益气健脾、清热化湿为治疗原则，组方严谨、科学、合理，符合中医理论。方中取四君子汤益气健脾；土茯苓、菝葜清热化湿；八月扎、陈皮、鸡内金理气健脾。各药物在作用上相辅相成，具有协同作用，共奏健脾益气、扶正解毒之功。多联合化疗，可降低结直肠癌术后复发转率，改善患者术后生存质量[7]。

本实验结果发现中药复方肠益煎可以稳定患瘤裸鼠体质量，联合化疗药物5-氟尿嘧啶、奥沙利铂能够增加抑制肿瘤瘤体生长之效，发挥抑瘤作用，具体分子机制还有待进一步研究。

[1] 全国肿瘤防治研究办公室,全国肿瘤登记中心,卫生部疾病预防控制局. 中国部分市、县恶性肿瘤的发病与死亡(第3 卷)[M]. 北京: 人民卫生出版社,2007

[2] 孙燕. 内科肿瘤学[M]. 北京：人民卫生出版社,2001：623-624

[3] Park YJ，Park KJ，Park JG,et al. Prognosis factor in 2230 Korean colorectal cancer patients:analysis of consecutively operated cases[J]. World J Surg,1999,23(7):721-726

[4] 杨静. 健脾导滞法联合化疗治疗晚期肠癌临床观察[J]. 实用中医内科杂志，2008,22(8):30-31

[5] 张青,王笑民,杨国旺,等. 固本消瘤胶囊联合 FOLFOX4化疗方案治疗晚期大肠癌的临床研究[J]. 北京中医药,2010,29(4):255-257

[6] 蒋益兰,潘敏求,蔡美. 健脾消癌饮配合化疗拮抗大肠癌术后复发转移62例总结[J]. 湖南中医杂志，2007,23(1):1-3

[7] 王文海，周荣耀. 肠益煎治疗大肠癌术后50例临床观察[J]. 浙江中西医结合杂志，2000，10(6)：325-326

Experimental study on anti tumor effect of Changyi Decoction on nude mice with transplanted colorectal cancer

WU Tingting1, WANG Yanying2, ZHONG Yi1, ZHANG Shiqiang1, CAO Shengcheng3, ZHANG Haisheng3

(1.Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai University of TCM, Shanghai 200082; 2.Zibo Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Zibo 255000, Shandong, China; 3.Fangta TCM Hospital of Songjiang District, Shanghai 201600, China)

Objective It is to investigate the anti rumor effect of Changyi Decoction on nude mice with transplanted colorectal cancer (CRC). Methods 60 nude mice with inoculation by transplant Colorectal Carcinoma LOVO cell suspension under their skin were randomly divided into 6 groups as model control group (Group A), Changyi Decoction group (Group B), 5-Fluorouracil group (Group C), 5-Fluorouracil+Oxaliplatin group (Group D), Changyi Decoction+5-Fluorouracil group (Group E) and Changyi Decoction+5-Fluorouracil+Oxaliplatin group (Group F), 10 mice in each group. Simulating the clinic, the mice were treated with normal saline (NS) in Group A, Changyi Decoction in Group B, 5-Fluorouracil (5-Fu) in Group C, 5-Fluorouracil and Oxaliplatin (L-OHP) in Group D, Changyi Decoction and 5-Fu in Group E, Changyi Decoction, 5-Fu and L-OHP in Group F. NS and Changyi Decoction were given by gavage once a day for 14 days with NS 20 mL/(kg·d) and Changyi Decoction 12.5 g/(kg·d). 5-Fu and L-OHP were given every other day by intraperitoneal injection for 5 times. In the course, mice weights were recorded. After treatment, the tumor weight was measured and tumor growth and inhibition rate were calculated. Results Mice weight after tumor removing of Group B, C, D, E and F were all markedly higher than that of Group A (allP<0.05), and which in Group D, E, F were higher markedly than those in Group B and C (allP<0.05), there was no significant difference among Group D, E and F (P>0.05). The tumor weight and tumor growth rate of Group C, D, E and F were lower markedly than those of Group A and B (allP<0.05), and which of Group D and F were higher markedly than that of Group C (P<0.05). The tumor inhibition?rate of Group B, C, D, E and F were higher markedly than that of Group B (allP<0.05), and which of Group D and F were higher markedly than that of Group C (allP<0.05). Conclusion Changyi Decoction can keep the weight of mice with CRC. It has some effect on tumor growth inhibition, and more effect to combine with chemotherapeutics such as 5-Fu and L-OHP.

Changyi Decoction; colorectal cancer; tumor growth rate; tumor inhibition rate; nude mice

吴婷婷，女，医学硕士在读，从事中医治疗恶性肿瘤相关研究。

钟薏，E-mail:zhongzixian2000@163.com

上海市教委创新项目(12ZZ123)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.005

R-332

A

1008-8849(2015)12-1267-03

2014-11-05