小儿启脾片微生物限度检查方法验证研究

颜明王东兴王艳美王宝庆

（1牡丹江市食品药品检验检测中心，黑龙江 牡丹江 157011；2牡丹江心血管医院；3牡丹江灵泰药业股份有限公司）

小儿启脾片微生物限度检查方法验证研究

颜明1王东兴2王艳美3王宝庆1

（1牡丹江市食品药品检验检测中心，黑龙江 牡丹江 157011；2牡丹江心血管医院；3牡丹江灵泰药业股份有限公司）

目的：验证小儿启脾片微生物限度检查的方法。方法：采用《中国药典》2010年版一部附录ⅧC微生物限度检查法，对小儿启脾片进行微生物限度检查。通过3次独立的平行试验,分别计算5种验证菌每次试验的回收率。采用在相同环境下培养和观察大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌的方法来验证控制菌。结果：5种验证菌的回收率均高于70%；控制菌检查中,试验组均检出验证菌,阴性菌对照组均无生长。结论：可以采用常规方法检查小儿启脾片的微生物限度。

小儿启脾片；微生物限度检查；方法学验证

小儿启脾片是《国家食品药品监督管理局国家药品标准》所收载的品种，该药品是由人参、山药、山楂、茯苓、莲子、白术、陈皮、泽泻、麦芽、六神曲10味药组成的复方制剂，主要用于治疗脾胃虚弱，食欲不振，消化不良，腹胀便溏等。本组方中山楂、白术、陈皮和六神曲[1-5]均报道有抗菌或抑菌的作用，因此按照常法检验其微生物限度得到的结果不准确，根据《中国药典》2010年版规定，必须采用方法学验证试验说明微生物限度检查法结果准确性和试验方法的可靠性[6]。本研究对小儿启脾片微生物限度检查方法验证研究报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

BSC-1100ⅡB2生物安全柜；PL202-L电子天平；PL202-L架盘药物天平；LDEX-40Ⅱ立式自动电热压力蒸汽灭菌锅；360-HHB-420BS恒温培养箱；HPS-280生化培养箱；CJ-C-DⅡ层流洁净工作台；SY101-S-Z电热鼓风干燥箱；LDE4-1.2离心机；HHS11-2-Ⅱ电热恒温水浴器。

1.2 培养基

营养琼脂培养基（批号：130228）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号：130111）；营养肉汤培养基 （批号：130922）；胆盐乳糖培养基（批号：131012）；曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）（批号：130111）；改良马丁培养基（批号：130110）；4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）（批号：130117），均由北京叁药科技开发公司生产，中国食品药品检定研究院监制。

1.3 样品

小儿启脾片（牡丹江灵泰药业股份有限公司提供，批号：140102，140103，140104）。

1.4 验证菌种

枯草杆菌CMCC（B）63501，金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003，大肠埃希菌 CMCC（B）44102，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003，均由中国食品药品检定研究院提供，本试验所使用的菌株均为第3代。

2 方法和结果

2.1 菌液制备

参照《中国药典》2010年版一部附录[6]方法，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物到营养肉汤培养基中，经33～35℃培养18～ 35小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，经23～28℃培养18～24小时后，分别用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍稀释法依次稀释，金黄色葡萄球菌稀释至 10-7、大肠埃希菌稀释至10-7、枯草芽孢杆菌稀释至10-6，白色念珠菌稀释至10-6，制成约为50～100 cfu/m L的菌悬液，做活菌计数备用；接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，经25℃培养7天，用5 m L含有0.05%聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子，吸取此溶液1 m L，用含有0.05%聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液按10倍稀释法稀释至10-5，约为50～ 100 cfu/m L，做活菌计数备用，本试验所使用的菌液均为第1代。

2.2 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨稀释剂制备

pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨稀释剂按照《中国药典》2010年版一部附录[7]方法制备。

2.3 供试液制备

取样品10 g，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨稀释剂100 m L，混匀，取约10 m L离心5分钟，500转/分钟，取上清液做为1∶10的供试液。

2.4 细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证（平皿法）

2.4.1 试验组取1∶10的供试液1 m L与上述制备好的阳性对照菌液1 m L置于平皿中，立即加入15～20m L相应培养基，待凝固后置规定条件下培养，测定所加的试验菌数，每株菌制备 10个平皿，逐日观察结果，计数。

2.4.2 菌液组取上述各菌液1 m L分别加入平皿中，立即加入15～ 20 m L相应培养基，待凝固后置规定条件下培养，逐日观察结果，测定每一菌株所加的试验菌数，每株试验菌平行制备2个平皿。

2.4.3 供试品对照组除不加菌液外，方法同试验组，测定供试品本底菌数。每株菌制备10个平皿。

2.4.4 稀释剂对照组取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨稀释剂1 m L代替供试液，方法同试验组，测定所加的试验菌数，每株菌制备10个平皿。

2.4.5 计算

试验组的菌数回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 × 100%。

2.4.6 试验结果见表1。

2.5 控制菌检查方法验证

2.5.1 大肠埃希菌和大肠菌群菌种：阳性对照菌——大肠埃希菌 （44102）；阴性对照菌——金黄色葡萄球菌（26003）。

2.5.2 试验组取1∶10的供试品10 m L加入胆盐乳糖培养基100 m L中，加入阳性对照菌大肠埃希菌菌液1 m L，摇匀，置35～ 37℃培养18～24小时，按相应的控制菌检查法检查。大肠埃希菌浓度同细菌、霉菌及酵母菌计数验证。

2.5.3 阴性对照组方法同试验组，取100 m L胆

盐乳糖培养基，加入1 m L阴性对照菌金黄色葡萄球菌，置35～ 37℃培养18～ 24小时，按相应的控制菌检查法检查。金黄色葡萄球菌浓度同细菌、霉菌及酵母菌计数验证。

2.5.4 试验结果见表2。

表1 细菌、霉菌及酵母菌数计数验证结果

表2 控制菌检查结果

3 讨论

小儿启脾片是含有多种有效成分的中药复方制剂，其中任何成分具有抑菌作用都可能影响微生物限度检查的准确性，因此本文以《中国药典》2010年版一部微生物限度检查法为依据，采用5种阳性对照菌的回收率试验作为评价标准，确定了小儿启脾片微生物限度检查的方法。

由表1试验数据可知，试验组的回收率大于70%，平行3次试验结果均符合规定，结果表明可以采用常规法以1∶10的溶液作为供试品溶液进行细菌、霉菌及酵母菌计数的检查；由表2可知，阴性对照组未检出大肠埃希菌和大肠菌群，试验组检出了大肠埃希菌和大肠菌群，结果表明可以采用常规法进行本品的控制菌大肠埃希菌和大肠菌群的检查。综上所述，常规法用于小儿启脾片的微生物限度检查，结果可靠。

[1] 李建华，胡金林.山楂的药理作用与临床应用[J].中国药物滥用防治杂志，2011，17（6）：334-336.

[2] 吴士杰，李秋津，肖学凤，等.山楂化学成分及药理作用的研究[J].药物评价研究，2010，33（4）：316-319.

[3] 宿廷敏，王敏娟，阮时宝.白术的化学成分及药理作用研究概述[J].贵阳学院学报（自然科学版），2008，3（2）：32-35.

[4] 李伟伟，张国伟.陈皮黄酮类成分研究进展[J].中国医学创新，2014，11（24）：154-156.

[5] 王秋红，付新，王长福，等.六神曲的抗菌活性研究[D].中华中医药学会中药炮制分会2009年学术研讨会论文集，2009.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅧC，79-88.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅧH，104.

Research on M ethod Validation of M icrobial Lim it Test for Pediatric Qipi Tablets

Yan M ing1，Wang Dongxing2，Wang Yanmei3，Wang Baoqing1（1 Food and Drug Inspection Testing Center of Mudanjiang City,Heilongjiang Mudanjiang 157011,China；2 Mudanjiang Cardiovascular Hospital;3 Mudanjiang Lingtai Pharmaceutical Co.,LTD.）

Objective:To validate the method of m icrobial limit test for pediatric qipi tablets.M ethods:The method of microbial limit test set forth in the appendixⅧ C of the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition was adopted to determine the microbial limit of pediatric qipi tablets.Through three independent parallel tests,the recovery of each test using five kinds of bacteria for validation was calculated respectively.In order to verify the control bacteria,E.coli and Staphylococcus aureus were cultured and observed at the same environment.Results:The recovery of five kinds of bacteria was all higher than 70%,and bacteria for validation were detected in the test group,but no grow th was observed in the negative control group.Conclusion:The conventional method can be used for the m icrobial limit test of pediatric qipi tablets.

Pediatric Qipi Tablets；M icrobial Lim it Test；Methodology Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.05.005

2015-01-30）

颜明，女，副主任药师。研究方向：药品监督检验与药品不良反应监测。E-mail：88934182@qq.com