生物大分子核酸药物制剂的研究现状与展望

杜子秀

（上海交通大学药学院，上海200240）

生物大分子核酸药物制剂的研究现状与展望

杜子秀*

（上海交通大学药学院，上海200240）

目前生物大分子核酸药物研发亟待突破的瓶颈是，如何使核酸药物能克服生物学屏障，实现体内有效输送。无生物安全隐患并具低免疫原性、高基因包封能力和易于制备的非病毒载体仍存在输送效率低和化学毒性大等缺陷，其临床应用受到限制。介绍核酸药物的研发现状，主要对非病毒核酸载体的研究现状及发展动态进行总结性回顾分析，并指出，虽然非病毒载体尚存在不足之处，但其自身优势仍使其具有成为未来核酸药物输送体系主体的广阔应用前景。

核酸药物；非病毒载体；聚合物；脂质体；体内输送；生物学屏障

编者按：2014年11月，由国家自然科学基金委员会主办，中国药科大学生命科学与技术学院、中国药科大学科技处、《药物生物技术》、《药学进展》、常州千红生化制药股份有限公司、江苏省生物化学与分子生物学学会等协办的“生物药物研发与创新青年学者高峰论坛”在中国药科大学召开，为广大医药领域研究人员特别是青年学者搭建了交流学术观点、分享研究成果的宝贵平台。会议期间，来自中科院、第四军医大学、北京大学、复旦大学等多家具有国内顶尖生物制药研究实力的科研机构的专家学者们围绕“生物药物领域的发展趋势、前景预测和展望”、“生物药物研发与产业中的新思路、新技术、新方法”、“生物药物成药性研究”等主题展开了充分交流与探讨。医药产业关系国计民生，在国家经济发展中具有举足轻重的地位，而生物制药更是具有巨大的发展前景。本刊编辑部特邀部分专家作客本期“生物制药论坛”栏目，与读者分享他们在该领域的科研思路和精彩观点，为生物药物的研发提供参考。

1 核酸药物的研发现状

核酸药物（包括siRNA、DNA、miRNA和shRNA等）具有结构和治疗靶点明确、制备简单、生产时间短等优点[1]，是生物大分子药物发展的一个重要组成部分，但其致命弱点是易在体内降解以及难以到达治疗位点，因此，对核酸药物输送体系的研发是核酸药物发展的关键所在（Fire等, Nature, 1998年）。虽然近年来国内外有关核酸药物载体的研究报道较多，但尚未见有将核酸药物应用于临床研究的介绍，甚至据《生物谷》报道，一些公司关闭了相应的研究机构，如罗氏与诺华公司先后退出对RNAi药物的研发。而涉足核酸药物研究的科学家也被医药界形容为只是在相关期刊上发表论文而没有实际进展。这些均缘于核酸药物的体内输送问题成为其研发过程中难以突破的瓶颈。

2014年，RNAi药物在经历了几年沉寂后再次成为各大生物医药公司投资的焦点，如罗氏公司在4年后重返RNAi药物的研发，赛诺菲公司也开始介入RNAi药物研发领域。究其原因，是美国Alnylam公司宣称对RNAi药物体内输送问题有望有所突破。著名市场研究公司Allied在《美国商业资讯 》上发表报告称，未来RNAi药物将呈现高速增长趋势，到2020年这类药物销售额将有望突破12亿美元，平均年增长率将保持在28.4%左右。就目前的文献与公开专利来看，核酸药物在体内输送中的路径仍尚未打通。那么核酸药物的体内输送路径究竟能否打通？若能，非病毒载体还是病毒载体在其中的应用前景更广阔？核酸药物未来发展的走向如何？让我们带着这些问题来对核酸药物输送体系的国内外研究现状及发展动态作一分析。

2 非病毒核酸载体的研究现状及发展动态

核酸药物的体内输送载体主要分为病毒载体和非病毒载体，病毒载体虽然输送效率高，但因自身难以克服的缺陷而限制了其用于核酸药物输送体系[2]，如：1）其只能整合到分裂期细胞；2）其可插入的外源基因片断较小（＜10 kb），难以满足较大基因的插入；3）病毒的生物毒性是限制其临床应用的主要方面；4）其有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能，随机整合可能产生不良作用。

一些重大疾病如癌症被发现时大都已发生转移，必须通过系统给药。而面对复杂的体内环境，如何安全有效地将核酸药物输送到治疗位点，将成为一大难题。鉴于病毒载体存在诸多缺点，没有生物安全隐患的非病毒载体承载着打通靶细胞内外两个不同环境的生物学壁垒、同时又不影响正常组织细胞、且能定向寻找并到达病灶、及时释放药物的重任[3]。目前，用于核酸药物输送研究的非病毒载体材料主要有阳离子聚合物或脂质体以及二者复合物等。然而，经过三十多年的研究，所发现的绝大多数非病毒载体材料尚难以成为药用载体[4]。特别是，要完成核酸在动物体内的有效输送，单纯依靠聚合物或脂质体作为载体，是无法实现的。下面将对国内外的非病毒载体研究进行较为深入的分析，以便找出这些载体系统的优势与缺点，探究非病毒核酸载体的未来走向。

2.1 聚合物和脂质体单独用作载体

2.1.1 阳离子聚合物 阳离子聚合物作为载体，可与核酸通过静电作用而自组装形成纳米级复合物（Polyplexes），用于输送核酸药物。目前常用的阳离子聚合物除了已广泛应用的聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）[5-6]、壳聚糖和树枝状聚合物[7]（又见：Wolfert等, Bioconjugate Chem, 1999年）外，还有近来发现的聚羧酸酯[8]、聚磷酸酯[9]、β-氨基酯[5]以及含氮杂环等酸碱敏感性聚合物等新型可生物降解阳离子聚合物[10-11]。虽然这些阳离子聚合物用作核酸转染试剂时显示出相当的活性，但作为核酸药物载体，其仍然存在自身化学毒性大的缺点，并且难以同时实现对核酸的紧密包裹与有效释放。同样，近年来一些带正电荷的多肽也被用作核酸载体[12]，虽然其毒性很低，但单独输送核酸的能力很差，需要加入氯喹来提高转染效率，这可能与其较小的分子质量、较低的胺基密度以及易在内涵体中降解有关[13-14]。

阳离子聚合物与核酸形成的Polyplexes表面通常带正电荷，为了实现体内长循环与特定细胞靶向性，有研究者采用阳离子聚合物共价接枝聚乙二醇（PEG）和靶向基团[15]的方法来屏蔽Polyplexes表面正电荷，并实现对目标组织细胞的靶向性。这种方法在一定程度上降低了载体的毒性，且相对延长了核酸输送体系的体内循环时间，但其很难有效实现组织靶向性，因为阳离子聚合物在与核酸复合的过程中，容易将高分子链末端或侧链上的靶向基团包裹起来，而且单纯的化学接枝方法只能提供单功能靶向某类受体的可能，而针对不同的病变细胞，不能灵活变换相应的靶向基团。此外，在阳离子聚合物的合成过程中，难以精确控制聚合物的分子质量与结构，重复性较差。

综上所述，阳离子聚合物作为核酸载体的优点是可以灵活调节结构、分子质量和电荷密度，并且包载量大，但由于其分子质量与结构难以精确控制，重复性较差，从而导致不可控的化学毒性和难以形成稳定而连续的组装体系，所以其成药性差。聚合物作为核酸载体的另一个缺点是包裹药物不够紧密，难以避免循环过程中漏药以及药物被降解等问题。因此，虽然国内外对诸多功能化阳离子（或结合阴离子）聚合物用作核酸载体的研究进行了大量报道[16-20]，但这些载体系统均未能突破核酸输送过程中的生物学屏障。

2.1.2 阳离子脂质体 两亲性小分子阳离子脂质通常含有带正电荷的头部和疏水的碳烃链段，可与中性脂质在水中形成较稳定的阳离子脂质体。相比于阳离子聚合物，阳离子脂质体结构更接近细胞膜，更易被体内接受，其毒性明显降低[21]。阳离子脂质体与核酸通过静电作用进行自组装形成复合物（Lipoplexes）[22]，通常认为阳离子脂质体的转导是Lipoplexes与内涵体膜融合的结果[23]，膜融合可使脂质体直接进入细胞质[24]（又见：Xu等, Biochemistry, 1996年）。目前针对阳离子脂质体用作核酸载体的研究大多是围绕通过对脂质的化学修饰(如PEG化和连接靶向基团等)[25-26]来突破生物学壁垒而实现长循环与特定靶向等展开，但大量文献显示，单纯对脂质体进行化学修饰，不仅会带来新的化学毒性，而且也难以有效突破生物学壁垒而实现对生物大分子核酸药物的体内输送[3,27]。

脂质体作为核酸载体的优点是，其与细胞膜结构相似，易于突破细胞膜与内涵体膜，并能完全将药物封闭在其水相内，且其本身毒性非常低，不足以对人体造成大的伤害。目前已经有许多商业化的脂质材料可供选购，但未修饰的阳离子脂质体只能起到包裹核酸与突破胞膜的作用（Xu等, Biochemistry, 1996年），并无主动靶向功能，仍难以用于制备核酸药物制剂。

2.2 聚合物与脂质体的复合物载体

为了开发出更有效的核酸体内输送载体系统，将聚合物（如阳离子聚合物、带正电荷的蛋白质或多肽等）与脂质体相结合而构建的纳米载体（Lipopolyplexes）应运而生[28-30]。其中，报道较多的是，先利用阳离子聚合物与核酸形成带负电荷的纳米颗粒Polyplexes，然后通过静电作用将Polyplexs与阳离子脂质体复合，制得Lipopolyplexes[28-29]。其优点是，核酸包载量增大，并能实现与功能化脂质体（如PEG化并连接不同靶向基团的脂质体）有效结合。其缺点是，所用阳离子聚合物仍然局限于常用的转染试剂，化学毒性较大，且尚未克服阳离子聚合物或脂质体单独用作核酸载体时所具有的缺陷；虽然也有利用带正电荷的蛋白质代替阳离子聚合物以克服阳离子聚合物所致化学毒性等缺点的报道[31-33]，但蛋白本身成本高，且难以同时实现对核酸的紧密包裹和有效释放；而利用无机盐代替阳离子聚合物制备Lipopolyplexes[34]，除了制备过程繁琐外，也没有克服脂质体作为核酸载体时所具有的缺点，其体内输送核酸性能并不理想。由此可见，上述Lipopolyplexes的构建方法只是将两种组分简单垒加，并没有从根本上将二者进行有机融合。

另一种组装模式是，采用模块化设计方式将连接靶向肽序列的阳离子多肽和阳离子脂质体联合包裹核酸，构建受体靶向纳米复合物载体（receptor-targeted nanocomplexes, RTNs）[35]（又见：Hart等, Hum Gene Ther, 1998年）。该方法的特点是，各组分既相对独立（没有通过化学键结合），又能够有机统一地组装（不再是各组分简单的垒加）。通过多肽组分包裹核酸，并能靶向细胞表面的受体[36]，而利用脂质组分的融膜作用又可突破细胞和内涵体膜[37]，实现内吞功能，该方法有效地克服了阳离子聚合物分子质量不确定和化学毒性大等问题，提高了核酸的体内输送能力。可见，该组装体系为药用非病毒载体的构建提供了合理的新思路，是一种较好的通过整体协调效应组装的范例。然而，采用常规的短链PEG化来屏蔽纳米复合物表面正电荷，不仅会削弱多肽的靶向功能，且屏蔽效果并不理想，还会造成蛋白吸附等不良反应，导致体内输送效率不高[35-36,38]（又见：Hart等, Hum Gene Ther, 1998年），难以成为核酸输送的药用载体。而且，到目前为止，RTNs的内部组装结构尚不明确，势必阻碍其在核酸药物体内输送系统中的应用。

3 展望

从以上分析可以看出，利用聚合物与脂质构建非病毒核酸载体，具有一定的应用潜力，但需要针对体内的生物学壁垒，合理利用二者的优势并避免各自的缺点，进行有效组装，且所用生物材料必须是人体能够接受的医用分子。如利用多肽和脂质体这些对人体安全的生物材料，通过整体协调效应组装而构建的RTNs，这是我们在今后研究中值得借鉴的一种非病毒载体构建模式。但这类构建模式还需进一步优化提高，如随着脂质体的不断优化发展，对脂质体模块的优化完善势在必行。

因此，要想实现生物大分子药物体内输送，最好的战略对策之一应是融合生物大分子和脂质体的优势，通过协同效应组装出智能型的纳米级生物大分子药物输送体系，而且，在设计时应尽量利用现有的已经证明对人体安全的生物医用材料或结构与分子质量明确可控的聚合物，如透明质酸等，虽然其具体分子质量难以确定，但并不影响其作为药物载体的鉴定、评判，可用于组装能应对体内复杂环境的纳米载体。笔者所在实验室即以RTNs为模型，利用医用大分子——透明质酸、特定肿瘤细胞穿透肽和市售的无细胞毒性的脂质协同核酸组装成能够在体内安全高效地输送生物大分子药物的多功能智能型纳米载体[39]，体内外实验的初步结果表明其具有良好的核酸输送效能，希望此组装模式能为生物大分子药物输送技术的发展提供新的思路。

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[专家介绍] 杜子秀：博士，副研究员，硕士生导师。2007年博士毕业于浙江大学高分子化学与物理专业。随后分别到上海交通大学和英国伦敦大学学院（UCL）师从金拓教授与非病毒载体专家Stephen L.Hart教授进行博士后研究工作。研究方向为生物材料与药物输送体系的构建，特别专注于生物大分子药物体内输送体系的研究。近年来以第一作者身份分别在Mol Pharm, Scientifc Reports, Macromolecules等SCI主流期刊上发表论文10篇，总它引为200多次，最高单引为102次。授权专利5项。分别获得中国博士后科学基金一等资助金和特别资助基金，国家自然科学青年基金。参与了十一五国家重大新药创制专项“针对生物技术药物的给药系统技术平台”和十二五国家新药创制专项“新型药物制剂和辅料的临床前研究”等多项研究。2010年获得上海交通大学晨星计划B类奖励。目前的主要研究兴趣是利用生物医用材料构建可成药的核酸药物输送体系。

Research Status and Prospect of Therapeutic Nucleic Acid Formulations

DU Zixiu
(School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Currently, the bottleneck that desperately needs to break through in nucleic acid drug development is how to overcome biological barriers in nucleic acid delivery in vivo.Despite the advantages of less biological toxicity, low immunogenicity, high capability of gene encapsulation and easy preparation, non-viral vectors are still restricted clinically by high chemical toxicity and low delivery effciency.In this article, the present situation of nucleic acid drug development was introduced, with emphasis on retrospective analysis of the research status and development trend of non-viral vectors for nucleic acid drugs.It was pointed out that non-viral vectors were still promising delivery systems for nucleic acid drugs in the future despite their various limitations.

nucleic acid drug; non-viral vector; polymer; liposome; in vivo delivery; biological barrier

Q52; R943

A

1001-5094（2015）03-0188-05

接受日期：2015-02-07

项目资助：国家自然科学基金(No.30901881)；上海市闵行区2013年度产学研合作计划项目（No.20121012634480）

*通讯作者：杜子秀，副研究员；

研究方向：生物材料和药物输送；

Tel：021-34204739；E-mail：zixiudu@sjtu.edu.cn