人血清白蛋白融合技术研究进展

刘文慧，吴敏，沈其，徐迎春，陈枢青*

（1.浙江大学药学院生化药学研究室，浙江 杭州 310058；2.浙江海正药业有限公司，浙江 台州318000；3.休斯顿医学研究所，休斯顿，77030）

人血清白蛋白融合技术研究进展

刘文慧1，吴敏2，沈其3，徐迎春1，陈枢青1*

（1.浙江大学药学院生化药学研究室，浙江 杭州 310058；2.浙江海正药业有限公司，浙江 台州318000；3.休斯顿医学研究所，休斯顿，77030）

结合笔者所在课题组的实验研究成果，综述人血清白蛋白融合技术研究进展。人血清白蛋白融合技术是近些年来应用较多的用于改造小分子蛋白和多肽药物的手段。但是众多的研究结果发现将小分子蛋白/多肽和人血清白蛋白融合后会出现一些共性的问题，例如目标蛋白产率低、易降解等。这些共性问题可以通过融合蛋白的优化设计、蛋白酶缺陷宿主的构建、融合基因多拷贝以及与分子伴侣共表达得以解决。

人血清白蛋白融合技术；共性问题；优化设计；蛋白酶缺陷宿主；多拷贝；分子伴侣

接受日期：2015-02-03

*通讯作者：陈枢青，教授；

研究方向：微生物与生化药学；

Tel：0571-88208411； E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn

目前临床上使用的一些蛋白和多肽类药物，如胰岛素、干扰素、细胞因子等，具有疗效高、副作用少、免疫原性低等优点，但是由于其相对分子质量较小，易被肾脏快速清除，在人体内的半衰期较短，临床使用时为了维持药效需要频繁给药，进而极大地限制了这类药物在临床上的应用，因此对这类药物进行以延长药效为目的的改造已迫在眉睫。目前比较常用的对这类药物进行的长效改造策略主要包括：构建蛋白突变体、制备缓释制剂以及与相对分子质量较大的药物载体[如聚乙二醇（PEG）、人血清白蛋白（HSA）、抗体Fc片段等]相连。近年来，利用HSA改善小分子药物药代动力学性质的相关技术得到了广泛应用[1-2]。

HSA融合技术的基本原理是运用PCR技术将HSA基因和目的基因进行基因融合，再转染到真核表达系统（如酵母）中进行表达。HSA是人体内源性蛋白，具有诸多优势，例如能结合和运输大量内源性和外源性物质，无明显毒性和免疫原性，体内半衰期长达19 d，因此是改造修饰小分子药物的理想载体。目前处于临床研究阶段的HSA融合蛋白主要有用于治疗慢性丙型肝炎的HSA/α干扰素（IFN-α）、治疗嗜中性粒细胞减少症的HSA/粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、治疗充血性心衰的HSA/脑钠肽（BNP）等。2014年美国FDA批准了首个HSA融合蛋白药物阿必鲁泰（albiglutide，Tanzeum），其为二肽基肽酶Ⅳ（DPPIV）耐受的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和重组HSA的融合蛋白，是一种用于治疗2型糖尿病的长效生物药物[3]，其成功上市为诸多HSA融合蛋白药物的上市带来了希望和动力。小分子蛋白/多肽药物和HSA融合后虽然能够显著延长药物的半衰期，但是在一些研究中发现HSA融合蛋白在表达过程中会出现一些共性的问题，如融合蛋白的体外生物学活性有着不同程度的降低、表达产物不均一、易降解、表达水平低等。这些共性问题与HSA及目的蛋白的性质、融合方式以及融合蛋白的糖基化水平、表达载体和表达宿主的选择等紧密相关。

白介素1受体拮抗剂（IL1Rα）是特异性的天然拮抗剂分子，临床上主要用于中度及重度类风湿性关节炎的治疗，近些年来的一些动物实验以及临床试验研究表明其对2型糖尿病有着显著的治疗效果；人生长激素（hGH）是人体内重要的多功能激素，具有促进生长和蛋白质合成以及影响脂肪与糖代谢的功能，临床上主要用于成人和儿童生长激素缺乏症、Turner综合征等；人甲状旁腺激素1-34（PTH1-34）是人体内调节钙磷代谢的重要因子，具有抗骨重吸收和促骨重吸收的双重作用，临床上主要用于骨质疏松症的治疗。这3种药物均由于分子质量小、半衰期短，从而使其在临床上的应用受限。笔者所在课题组通过将其与HSA融合，使药物的半衰期得到了显著的延长，但同时也伴随着一些共性问题的出现。本文主要以HSA/IL1Rα、 HSA/hGH和HSA/PTH1-34这3种HSA融合蛋白为例，结合笔者所在课题组的实验研究成果，对HSA融合蛋白在表达过程中存在的一些共性问题进行探讨并寻找解决方法，同时对HSA融合技术的研究进展作一综述，旨在为长效蛋白和多肽类药物的开发提供参考。

1 HSA融合蛋白的优化设计

由于HSA的融合会影响目的蛋白的正确折叠、糖基化位点的暴露程度以及活性位点的功能，从而导致融合蛋白表达产物不均一、不稳定以及活性降低，因此需要设计优化HSA与目的蛋白的连接形式。HSA融合蛋白的优化设计主要包括目的蛋白与HSA的融合方向和连接肽（包括长度）的选择。

1.1 目的基因的融合方向

目的基因一般可融合在HSA的N端、C端或者两端，二者融合方式不同，所表达融合蛋白的均一性、稳定性、生物活性甚至表达水平也都会呈现差异。Ding等[4]通过实验研究分别考察了BNP与HSA的不同融合方向以及融合不同个数的BNP分子后对融合蛋白表达与活性的影响，结果发现，BNP融合在HSA C端而形成的HSA/(BNP)2激活人利钠肽受体-A（hNPR-A）的活性与BNP相当，生物活性保留水平最高，而BNP/HSA、(BNP)2/HSA和(BNP)4/HSA这3种融合形式对BNP生物活性的保留水平较低；就表达水平而言，BNP/HSA的表达水平最高，(BNP)4/HSA的表达水平最低。笔者所在课题组则分别考察了IL1Rα、hGH和PTH1-34融合在HSA的N端及C端后的表达与活性，结果显示，IL1Rα融合在HSA的N端以及hGH和PTH1-34融合在HSA的C端，其融合蛋白在保留生物活性的同时体内半衰期也得到显著延长，融合蛋白的均一性和稳定性均优于另一种融合方式。而且，笔者所在课题组还进一步考察了hGH融合在HSA分子两端后的表达与活性，结果发现其融合蛋白无表达，究其原因，可能是由于目的蛋白融合在HSA的两端后会对融合蛋白的分泌过程产生影响[5]。

1.2 连接肽的选择

在构建融合蛋白时，将HSA和目的蛋白直接相连，可能会影响目的蛋白的正确折叠和天然构象，从而易导致其功能受损甚至生物活性下降，因此需在两蛋白成分间引入连接肽。Zhao等[6-7]在研究中发现，直接将IFN-α2b和HSA融合，会严重降低IFN-α2b的抗病毒活性，而在两蛋白成分间分别引入连接肽GGGGS、PAPAP和AEAAAKEAAAKA，以减少两个结构域之间的相互干扰，结果，这3种连接肽的引入分别使IFN-α2b的抗病毒活性提高了39%、68%和115%。

连接肽的选择与设计一般从两方面考虑：1) 连接肽的长度应适宜，因为引入的连接肽序列对于人体是异源物质，肽链越长越容易产生免疫源性，且会造成两个蛋白的协同作用减弱，而肽链太短则会形成空间位阻，影响融合蛋白的活性；2) 连接肽应具备一定的稳定性，其需对蛋白水解酶有较高耐受度[8-9]。研究表明，可以利用连接肽设计工具[如LINKER、网络程序(http://www.ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww/)等]以及数据库，并根据融合蛋白的性质以及对连接肽的要求（如连接肽的长度、可溶性以及需避免的蛋白水解酶敏感序列）来设计适宜的连接肽[10]。目前比较常用的连接肽包括柔性连接肽(GGGGS)n和(G)n[11-12]以及刚性连接肽(EAAK)n和(XP)n[13-14]，其中(GGGGS)n是目前最为普遍使用的连接肽。笔者所在课题组选择(GGGGS)n作为连接肽，比较了n分别为0、1和2时 (GGGGS)n对融合蛋白HSA/hGH的稳定性和体外生物活性的影响。结果发现，与n为0相比，n为1和2的(GGGGS)n所构建的融合蛋白的体外稳定性较高，但是三者体外生物学活性没有显著差别。由于连接肽数引入过多会造成其抗蛋白酶降解能力下降，因此笔者所在课题组选择n为1的(GGGGS)n作为最佳连接肽。

2 HSA融合蛋白的降解改善途径

各种HSA融合蛋白在酵母系统表达时都会发生不同程度的降解，一般目的蛋白融合在HSA的C端时会产生约45 000的降解条带，如HSA/hGH、HSA/ PTH1-34；而融合在HSA的N端时则会产生一个约45 000加上目的蛋白长度的降解片段。造成酵母表达系统中外源蛋白降解的主要原因包括宿主菌株的蛋白水解酶以及培养过程中外源环境压力，其中，外源环境压力可以通过改变培养条件和培养基的组成而加以改善，而蛋白水解酶的影响可通过添加蛋白酶抑制剂或者蛋白酶的竞争底物等来减弱[15]。然而，这些方法具有菌株和蛋白特异性，并不能有效解决融合蛋白降解问题。近年来的研究表明，构建蛋白酶缺陷宿主，是改善外源蛋白特异性降解的有效方法[16-17]。

有研究报道，液泡蛋白酶是导致外源蛋白在毕赤酵母中发生降解的主要原因[18]，其中影响较大的是蛋白酶A（PrA）和蛋白酶B（PrB）。因此，笔者所在课题组利用商品化的敲除了PrA的SMD1168以及敲除了PrA和PrB的SMD1163缺陷菌株来表达IL1Rα/ HAS和HSA/PTH1-34，结果显示，这两种融合蛋白的降解现象得到了显著改善。此外，本课题组还通过N端氨基酸测序并利用MALDI-TOF对IL1Rα/ HSA降解位点进行鉴定，结果根据所获位点信息，发现降解很可能是由酵母宿主内的精氨酸水解酶引起。而Kerry-Williams等[19]在用酿酒酵母表达rHSA时发现，YPS3的缺失可以显著抑制45 000 HSA降解条带的产生。所以，笔者所在课题组利用同源重组法在毕赤酵母GS115中构建了7种单一敲除YPS1、YPS2、YPS3、YPS7、MKC7、YPS’或YPS”的蛋白酶缺陷菌株以及同时敲除YPS1和PrA的缺陷菌株，并用于HSA融合蛋白的表达。结果显示，用于融合蛋白表达的前7种单一基因敲除菌株均未显著改善IL1Rα/HSA和HSA/PTH1-34的降解现象，而同时敲除了YPS1和 PrA的缺陷菌株中，HSA/PTH1-34的降解现象得到显著改善，融合蛋白表达的完整度由原来的30%提高到80%[20]。近些年来的研究表明，系统性筛选出一些蛋白水解酶，并将其共同改造，是改善蛋白降解的最佳途径。Idiris等[21]以hGH为研究对象，在裂殖酵母中分别敲除了52种蛋白水解酶，成功筛选出13个能够有效表达hGH的缺陷菌株；在此基础上，将筛选出的蛋白水解酶基因进行多个共同敲除，成功构建了一株敲除了8个蛋白水解酶的缺陷菌株，从而使hGH的表达水平提高了约30倍，证明了系统性筛选多个蛋白酶缺陷菌株方法的可靠性。

3 HSA融合蛋白的高表达策略

酵母表达系统中外源蛋白的表达水平可从毫克到克级不等，而表达水平较低仍是酵母系统表达外源蛋白所面临的一个共性问题。笔者所在课题组在研究IL1Rα/HSA、HSA/hGH和HSA/PTH1-34的 前 期，以pPIC9为表达载体，在毕赤酵母中进行融合蛋白的分泌表达，结果，蛋白表达水平较低，约只有20～50 mg·L-1。这不仅限制了融合蛋白的临床前研究进展，而且增加了后续产业化生产的成本。而在高密度发酵水平上，外部培养条件便是造成外源蛋白表达水平低的主要原因。因此，可通过对外部培养条件的优化来提高蛋白的表达水平，其中主要包括优化培养基的组成、温度、DO、pH、碳源的流加方式等。但笔者所在课题组在实验研究中发现，发酵水平上的优化并未能显著改善IL1Rα/HSA、HSA/hGH和HSA/ PTH1-34的表达水平。近年来的研究则表明，遗传宿主改造是改善酵母表达水平的有效手段，在遗传宿主改造方面影响蛋白表达的因素主要包括外源蛋白的性质、密码子的偏好性、基因中AT的含量、启动子和信号肽的选择、目的基因的拷贝数以及蛋白的折叠与分泌效率等[22]，其中，增加基因的拷贝数以及共表达与蛋白折叠和分泌相关的分子伴侣，对提高蛋白表达水平的效果最为显著[23-24]。笔者所在课题组的研究结果显示，通过增加IL1Rα/HSA、HSA/hGH和HSA/ PTH1-34的融合基因拷贝数至2～3时，蛋白的表达水平最高，较单拷贝表达水平约提高了2倍，但进一步增加拷贝数，融合蛋白的表达水平并没有继续增加。提示，在蛋白表达过程中，目的基因的拷贝数存在一个最优值，高于或低于此值时，蛋白的表达均会受影响[25-26]。接下来，通过对酵母细胞内残留的融合蛋白进行分析，发现高拷贝菌株中融合蛋白的胞内残留量明显高于低拷贝菌株，说明，随着基因拷贝数的增加，还有其他因素制约了蛋白的分泌。

新生肽在内质网折叠，是蛋白分泌过程中的关键步骤，而内质网的主要分子伴侣有蛋白质二硫键异构酶（PDI）、免疫球蛋白结合蛋白（BIP）和内质网氧化还原酶（ERO）。其中，PDI主要作用是促进新生肽二硫键的形成，Inan等[27]研究表明，通过共表达PDI，可以提高Na-ASP1多拷贝菌株的表达水平。BIP是ATP酶Hsp70家族成员，主要作用是帮助新生肽折叠、调节未折叠蛋白响应、促进ER钙库形成、靶向降解错误折叠蛋白（即ER-associated degradation， ERAD）等，研究发现，在酿酒酵母中，共表达BIP，可以使人红细胞生成素的表达水平提高5倍，牛凝乳酶的表达水平提高约26倍。ERO则主要负责为新生肽的形成提供所需的氧化当量。笔者所在课题组通过实验研究发现，多拷贝菌株与分子伴侣PDI和ERO共表达后，均能使IL1Rα/HSA和HSA/hGH的表达水平在多拷贝的基础上提高约2倍，最终使融合蛋白表达水平达到350～400 mg·L-1[26-28]；但多拷贝菌株和分子伴侣BIP共表达后，致使IL1Rα/HSA 和HSA/hGH的表达水平不仅没有提高反而降低，这可能是由于BIP除了具有维持新生肽稳定的作用外，还具有靶向降解错误折叠蛋白的作用所致[29-31]。

综上所述，HSA融合蛋白的优化设计、蛋白酶缺陷宿主的构建以及HSA融合蛋白的高表达策略，为众多HSA融合蛋白的研究提供了指导，并可广泛应用于对一系列HSA融合蛋白问题的研究。

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[专家介绍] 陈枢青：教授，博士生导师，中国药学会生物技术药物专业委员会委员，浙江省药学会生物药物专业委员会主任委员，《中国现代应用药学》杂志编委和《Medical Science Monitor》杂志国际编委。其研究领域包括：1）建立抗体偶联药物技术平台，设计新型高效低毒的抗肿瘤“生物导弹”；2）研究药物代谢酶类及其转运蛋白类基因的多态性，阐明药物使用在个体中的差异机制；3）利用基因重组技术设计具有生物活性的蛋白质新药。陈枢青教授所在研究室近五年中发表SCI论文33篇，授权中国发明专利9项，PCT 1项。

Research Progress in Fusion Technique of Human Serum Albumin

LIU Wenhui1, WU Min2, SHEN Qi3, XU Yingchun1, CHEN Shuqing1
(1.Department of Biochemical Pharmaceutics, School of Pharmacy, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2.Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000, China; 3.Houston Methodist Research Institute, Houston 77030, America)

The research progress in fusion technique of human serum albumin (HSA) was reviewed in this paper.Nowadays HSA fusion technique is a common and effective method for reforming small-molecule protein or peptide drugs.Many studies have shown that there are some common problems in the fusion of small molecule proteins or peptides with HSA, such as low yield and degradation of the target protein.However, these problems can be addressed by optimized design of the fusion protein, construction of protease-defcient hosts, multiple copies of fused genes and coexpression with chaperones.

human serum albumin fusion technique; common problems; optimized design; protease-defcient host; multiple copies; chaperones

Q789

A

1001-5094（2015）03-0199-05

·药学研究·
PHARMACEUTICAL RESEARCH