蟒蛇肉酶解肽电喷雾多级质谱法分析

高 颖，高晓晨，李晶峰，郭晓庆，张 辉，孙佳明

(长春中医药大学，长春130117)

蟒蛇，又名蟒，王蛇，蚺蛇，南蛇，埋头蛇，王字蛇，琴蛇，梅花蛇［1］，是当今世界上最原始的优质蛇种之一。蟒蛇肉在《名医别录》就有记载，其味甘，性温，有小毒。除手足风痛，杀三虫，去死肌，皮肤风毒疠风，疥辟恶疮。具有祛风活络，杀虫止痒的功效，可用于风痹，瘫痪，疠风，疥廨，恶疮 。在我国，蟒蛇主产于福建、广东、海南、广西、贵州、云南。近年来，蟒蛇的生存环境遭到破坏以及蟒蛇皮的市场需求加大致使蟒蛇的数量急剧下降，同时也刺激了蟒蛇的人工养殖。

生物活性肽(bioactive peptides)具有特殊的生物活性和生理功能，它一般是由3～20个氨基酸构成的多肽类物质，通常情况下，其分子量在1万Da以下。它由氨基酸组成，但其具有氨基酸所不能比拟的功效，生物活性肽源于蛋白质，但更易被人体吸收和利用，甚至会出现原蛋白质所不具备的新功能［2-3］。本文运用现代电喷雾多级质谱法对蟒蛇肉酶解肽进行了分析研究，解析其中酶解肽的氨基酸序列。

1 材料与仪器

1.1 材料 蟒蛇肉酶解肽由长春中医药大学中医药与生物工程研发中心自制。

1.2 仪器 Agilent 6350 ESI-MS(美国 Agilent公司);GL-20G-Ⅱ型低温超速离心机;FD-1000真空冷冻干燥机;UV-Visible Spectrophotometer;BP211D型十万分之一电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司)。

1.3 试剂 所用试剂均为色谱纯。

2 方法

2.1 样品制备 称取1g蟒蛇肉酶解肽冻干粉，用10%MeOH定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，滤过，即得。

2.2 质谱条件［4］电离源:电喷雾离子源(ESI);检测方式:正离子检测;扫描范围:m/z 50～500;干燥气温度:350℃;干燥气流量:10 mL/min;雾化气压强:0.24 MPa(35.0 psi);毛细管电压:4 kV。

2.3 样品分析 采用蠕动泵直接进样到离子源，利用质谱工作站所能提供的离子信息，对样品主要成分进行序列解析。从一级质谱图中，主要对m/z303、374的［M+H］+准离子峰进行分析，解析其主要寡肽类成分的氨基酸序列。

3 结果

3.1 m/z303离子的序列解析 一级质谱中m/z为303的［M+H］+离子峰，说明其分子量为302，氨基酸的平均分子量为128，根据氮律分子应含奇数个氮，推断其可能为三肽化合物。在碰撞诱导解离过程中，m/z 303离子失去一分子水(18 Da)生成m/z 285离子;m/z 303离子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 214离子;m/z 303离子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脱水缬氨酸(117 Da)生成m/z 115离子，m/z 115为天冬酰胺脱去氨基而生成的离子。结合肽类裂解规律的文献报道［5-7］，推知m/z为303的离子是由丙氨酸、缬氨酸和天冬酰胺三个氨基酸依次脱水形成酰胺键后生成的三肽，其氨基酸序列为AVN，结构式如图1。

图1 m/z 303离子结构式

3.2 m/z374离子的序列解析 一级质谱中m/z为374的［M+H］+离子峰，说明其分子量为373，氨基酸的平均分子量为128，根据氮律分子应含偶数个氮，推断m/z 374离子可能为四肽化合物。在碰撞诱导解离过程中，m/z374离子失去一分子水(18 Da)生成m/z 356离子;m/z 374离子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 285离子;m/z 374离子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脱水丙氨酸(89 Da)生成m/z 214离子;m/z 374离子失去一分子丙氨酸(89 Da)、一分子脱水丙氨酸(89 Da)和一分子脱水缬氨酸(117 Da)生成m/z 115离子;m/z 115为天冬酰胺脱去氨基而生成的离子。结合肽类裂解规律，推断m/z 374离子是由两个丙氨酸、一个缬氨酸和一个天冬酰胺4个氨基酸依次脱水形成酰胺键后生成的四肽，故m/z374离子的氨基酸序列为AAVN，结构式如图2。

图2 m/z 374离子结构式

4 讨论

生物活性肽具有多种生物学效应，如抗氧化、免疫调节、抗高血压、抗血栓、降低胆固醇、抑菌、抗病毒、抗肿瘤作用等，是筛选药物的天然资源宝库。研究发现蟒蛇肉酶解肽具有较好的抗氧化能力［8］，本文首次利用ESI-MSn对蟒蛇肉酶解肽进行了分析研究，从中解析出两个具有代表性的酶解肽的氨基酸序列，为蟒蛇进一步合理开发应用奠定了基础。

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