无绿藻分子生物学鉴定与分型研究新进展

李文静　刘锦燕　史册　王影　孙景勇　项明洁（1．上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海0005；．上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海0000；．上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科，上海0005）

·综述·

无绿藻分子生物学鉴定与分型研究新进展

李文静1，2刘锦燕2史册1，2王影1，2孙景勇3项明洁1，2
（1．上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海200025；2．上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海200020；3．上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科，上海200025）

以基因序列为鉴定基础的分子生物学方法以其客观、可重复性好等优点，被认为是分子鉴定无绿藻的“金标准”。该文对近年来应用在无绿藻鉴定和分型方面的实时定量PCR（Real⁃Time Quantitative PCR，RT⁃PCR）技术、单链构象多态性（Single Stranded Conformation Polymophism，SSCP）分析、限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）分析、高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）分析、质谱（Mass Spectrometry，MS）分析等分子生物学新技术和新方法进行综述。

无绿藻；分子生物学；PCR；质谱

［Chin J Mycol，2015，10（2）：126⁃128］

无绿藻（Prototheca）是一种单细胞生物，属于条件致病性真菌。根据形态特征，无绿藻属分为大型无绿藻（Prototheca stagnora）、中型无绿藻（Pro⁃totheca zopfii）、小型无绿藻（Prototheca wicker⁃hamii）、Prototheca ulmea、Prototheca blaschkeae及Prototheca cutis sp．nov．6个种［1⁃5］。根据生化、血清学、核糖体小亚基（SSU）18S rDNA测序等，中型无绿藻又可以分为基因型1和基因型2［1］。目前认为中型无绿藻、小型无绿藻、Prototheca blaschkeae和Protothecacutis与人和动物疾病都有关系［2，6］，其中对人有致病性以小型最常见［3］，截止到2012年全球已报道无绿藻病160例［7］。对动物有致病性以中型无绿藻基因型2最常见、毒力最强［8⁃9］。

目前无绿藻诊断主要依靠真菌学检查，但存在着耗时长、技术要求高、在鉴定分型至亚种或变种方面还有一定的难度等缺点［10］。而分子生物学方法快速、敏感且特异，具有较大的临床应用潜力。

1　基因序列同源性分析法

基因序列同源性分析是一种聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术与测序技术相结合的方法。2012年Sobukawa等［11］根据18SrDNA同源性将分离自不同奶牛场的无绿藻菌种鉴定为中型无绿藻基因型2。2013年NoriyukiHirose等［10］首先根据核糖体大亚基（LSU）rDNA D1／D2区域同源性从一名皮炎患者那里分离鉴定出小型无绿藻，然后将鉴定出的菌株和参照菌株的核糖体小亚基（SSU）rDNA、内部转录间隔区（ITS）、D1／D2的PCR产物分别进行比较，发现ITS片段在不同菌种间差别很大，大小顺序是小型无绿藻＞P．blaschkeae＞中型无绿藻＞P．cutis。不同小型无绿藻菌株的rDNA拷贝的ITS具有多态性，据此将小型无绿藻分为4个分支：A、B、C、D。

2　基于PCR的分子指纹图谱技术

2．1RT⁃PCR

实时荧光定量聚合酶链反应（Real⁃Time Quantitative PCR，RT⁃PCR）技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线等手段对模板进行定量分析的方法。2013年Masanobu Onoza⁃ki等［12］根据标准无绿藻菌株的18S rDNA构建特异性引物18PZF1和18PZR1和探针PZP1，再进行RT⁃PCR分析，将28个参照菌株正确鉴定至种水平，其中12个中型无绿藻正确鉴定至基因型水平，灵敏度达到50质粒拷贝／管。该方法可以在2～4 h内快速鉴定临床分离菌株。

2．2PCR⁃SSCP

PCR⁃SSCP，即PCR与单链构象多态性（Single Stranded Conformation Polymophism，SSCP）结合分析。2012年P Cremonesi等［13］将5种无绿藻参照菌株和50个临床分离株18S rDNA基因的两个区域PCR产物进行SSCP分析。发现5种参照菌株产生了5种不同的迁移图案，迁移速率由快到慢分别是中型无绿藻基因型2＞中型无绿藻基因型1＞P．Ulmea＞P．Blaschkeae＞大型无绿藻。50个临床分离菌株的迁移图案与中型无绿藻基因型2相同，结果与微生物学和基因测序的分型结果完全一致。PCR⁃SSCP是一种快速、简单、高度重复性的技术，对于从现场分离菌株中鉴定分型出无绿藻基因型2有重要临床价值，还可以鉴定出传统PCR方法无法鉴定的大型无绿藻和P．Ulmea。

2．3RFLP和PCR⁃RFLP

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术的基础是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小以反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况。2007年Möller等［8］利用RFLP技术成功鉴定出中型无绿藻和P．Blaschkeae，但却无法区分无绿藻的其他菌种。而PCR⁃RFLP技术，以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤，对DNA的量和纯度没有很高的要求，还可简化图谱的带型，易于分析［14］。2010年Tomasz Jagielski等［15］利用此技术，对分离自患有乳腺炎奶牛的44个无绿藻菌株进行分型，结果有43株为中型无绿藻基因型2，1株为P．Blaschkeae，这项结果与基因型特异性PCR鉴定结果完全一致。

2．4PCR⁃HRM

高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）技术原理是在标准PCR试剂的基础上加入饱和性荧光染料，扩增结束后运行HRM程序，通过实时监测升温过程中荧光强度变化，得出特征性熔解曲线，根据熔解曲线的差异进行突变检测、区分不同SNP位点与基因型［16］。2013年Hideto等［17］利用此技术正确鉴定了2株参照菌株和8株临床分离菌株，还发现中型无绿藻基因型1、中型无绿藻基因型2的50%荧光强度值分别是87．86℃和87．46℃。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。

3　生物质谱技术

质谱分析法（Mass Spectrometry，MS）利用电场和磁场将化合物形成的离子按质荷比的不同进行分离，从而进行成分和结构的分析，所得结果用质谱图（亦称质谱）表示。电喷雾电离（Electrospray Ionizsation，ESI）和基质辅助激光解吸电离（Matrix Assisted Laser Desorption Ionizsation，MALDI）是生物质谱中最具代表性的离子源，它们的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革，它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol（10⁃12mol）甚至fmol（10⁃15mol）的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能。

3．1ESI⁃MS

电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m／z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。2013年王璇［18］等将2株中型无绿藻rRNA的PCR产物用雅培PLEX⁃ID的通用传感器平台进行分析，它可以执行自动化的PCR后脱盐，ESI⁃MS信号采集，频谱分析，以及数据报告，结果PCR／ESI⁃MS可以准确地将这2株无绿藻鉴定到种水平。

3．2MALDI⁃MS

MALDI⁃MS，即Matrix Assisted Laser Desorption Ionizsation Mass Spectrometry，基质辅助激光解吸电离质谱。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离［19］。MAL⁃DI产生的离子常用飞行时间（Time⁃of⁃Flight，TOF）检测器来检测，MALDI⁃TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。2009年Von Bergen M等［20］利用MALDI⁃MS准确地将无害的和致病性的无绿藻鉴定到种水平，后来6种无绿藻的标准菌株MALDI⁃TOF MS的参照数据库也被建立，这提供了对于每种菌株覆盖了很宽的质荷比范围（2 000～20 000 Da）的可重复、独特的光谱图，2012年J．Murugaiyan等［21］使用主要光谱库（main spectra library，MSP）树状图将这种光谱图的可重复性进一步加强，这种MSP树状图几乎可以和以18S rDNA序列为基础的树状图媲美。MALDI⁃TOF MS为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，近年来在微生物的鉴定方面已经有了很广泛的应用［19］。

4　小　结

人类无绿藻病尽管并不常见，但由于对此菌的鉴定特征缺乏足够的认识，目前无绿藻病的诊断率远低于实际感染率［22］。无绿藻外形像酵母菌，但其治疗和预后却与酵母菌感染大不相同。在奶牛棚中无绿藻几乎无处不在，由无绿藻导致的奶牛乳腺炎是一种严重而复杂的疾病，这给乳制品行业造成了严重的经济损失。无绿藻导致的奶牛乳腺炎发病率近年来逐渐增加，这在全球范围内引起了广泛关注［17］。因此准确、快速、高效地鉴定与分型无绿藻对于流行病学研究、临床诊断和治疗都具有重要的意义。目前，随着分子生物学技术和交叉学科（如物理、化学、微电子等）的迅速发展，在无绿藻检测、鉴定和分型方面新的技术方法不断出现并显示了较好的应用前景，如基质辅助激光解吸电离质谱分析就以其简便快速、高通量、高灵敏度、高准确度、高分辨率、低成本等优势成为一种强有力的分析测试手段，有望取代现有的对于无绿藻的鉴定方法［19］。

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［13］Cremonesi P，Pozzi F，Ricchi M，et al．Technical note：Identifica⁃tion of Prototheca species from bovine milk samples by PCR⁃sin⁃gle strand conformation polymorphism［J］．J Dairy Sci，2012，95（12）：6963⁃6968．

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［本文编辑］王飞

New advance in the study of the molecular biological identification and typing of Prototheca

LI Wen⁃jing1，2，LIU Jin⁃yan2，SHI Ce1，2，WANG Ying1，2，SUN Jing⁃yong3，XIANGming⁃jie1，2
（1．DepartmentofLaboratory，RuijnHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200025；2．Radioimmunology and Clinical Laboratory，Luwan Branch，Ruijn Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200020；3．Department of Clinical Microbiology Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025）

The molecular biology method based on gene sequencing which is objective，highly reproducible and so on，is consid⁃ered the＂gold standard＂of Prototheca＇s molecular identification．To summarize the new molecular biology methods and techniques applied to Prototheca＇s identification and typing，such as real⁃time quantitative PCR（RT⁃PCR）technology，single strand conforma⁃tion polymorphism（SSCP）analysis，PCR⁃restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis，high resolution melting（HRM）analysis，mass spectrometry（MS）analysis．

Prototheca；Molecular biology；PCR；MS

R 519．5

A

1673⁃3827（2015）10⁃0126⁃03

李文静，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：15000028775＠163．com

项明洁，E⁃mail：mjxiang123456＠126．com

2014⁃11⁃28