无绿藻的微生物学特性和菌种鉴定

杨金 章强强

(复旦大学附属华山医院皮肤科，上海 200040)

无绿藻感染引起的无绿藻病是一种较罕见疾病，自1964年Davies[1]首次报道1例中型无绿藻 (Protothecazopfii)所致的皮肤无绿藻病以来，全球范围内已有190例文献报道，其中近1/3的无绿藻病例在最近10年内被报道，说明无绿藻病发病率有升高趋势。虽然无绿藻作为病原体在人群中发病机制尚不完全清楚，然而发病率的升高可能和免疫功能低下人群的增多有关[2]。为提高对无绿藻这一条件致病真菌的认识，以期对无绿藻病的诊治有进一步探索，本文对无绿藻的微生物学特性和鉴定方法进行简要综述。

1 分类学

从1894年Kruger首次分离出无绿藻[3]以来，无绿藻的分类一直受到争议。最初，根据在沙氏培养基培养后的酵母样外观，无绿藻被归为真菌，然而无绿藻既不能和酵母也无法和更低级别的藻类植物联系起来。1913年Chodat[4]根据无绿藻和小球藻相同的无性繁殖生成内孢子的繁殖方式，重新将其归于藻类。1930年Asdforth等[5]从热带口炎性腹泻的病例中分离出Protothecazopfii和P.portoricensisvar.trisporus，并确定这种生物可以在合成培养基上生长。Ciferri[6]在1957年将无绿藻重新归为酵母菌。目前普遍认为，无绿藻在进化过程中一定程度上由小球藻发育而来，同时在细胞壁组成、生理学和抵抗外界环境压力的能力有所不同[7-8]。无绿藻细胞壁含有的孢粉素是一种稳定的生物高聚物，使其可以抵抗机械压力、物理化学因素以及酶降解[9]。基于细胞壁的特征，目前无绿藻在生物学分类中处于真核生物 (Eukaryota)、绿色植物界 (Viridiplantae)、绿藻门 (Chlorophyta)、Trebouxlophyceae纲、绿藻目 (Chlorellales)、绿藻科 (Chlorellaceae)、无绿藻属 (Prototheca)[2]。

在过去，只有3种无绿藻被识别：大型无绿藻 (Protothecastagnora)、中型无绿藻 (Protothecazopfii)和小型无绿藻 (Protothecawickerhamii)[10]。然而从人和动物身上分离的几株菌株测序核糖体RNA结果显示，先前描述的中型无绿藻变种可能是不同的种类。中型无绿藻基因1型通常在牛粪中发现，然而大多数牛乳腺炎是由中型无绿藻基因2型导致。从猪粪而非牛粪中分离的中型无绿藻基因3型，被重新命名为Protothecablaschkeae。最近Kazuo等[11]在一位患者感染皮肤上得到的活检标本，通过组织病理和微生物培养发现并分离出一种新的无绿藻。通过分子鉴定等技术确定该菌株和小型无绿藻和小球藻有较近的系统发育关系，是无绿藻属的新种类，提出Protothecacutissp.nov。目前，普遍认为无绿藻属包括6个种：大型无绿藻 (Protothecastagnora)、中型无绿藻 (Protothecazopfii)、小型无绿藻 (Protothecawickerhamii)、Protothecaulmea、Protothecablaschkeae及Protothecacutis[12]。

2 流行病学

无绿藻广泛存在于自然界，通常能从植物表面、土壤或者水源中分离出，也可能暂时以菌落的形式存在于人或动物的消化道，有时定植在人体皮肤和甲床而无临床表现。然而因为无绿藻的腐生性质，它们更倾向于污水、牲畜粪液等潮湿环境来持续获得可供降解的有机物[10]。

无绿藻导致的无绿藻病是一种罕见、散发疾病。人、犬、猫及非家养哺乳动物均可能感染[13]。人类无绿藻的感染较多由小型无绿藻导致[14-15]，中型无绿藻感染的病例也有报道[15]，最近发现的P.cutis也能引起人感染造成皮肤损害[11]。其他几种无绿藻主要导致动物感染，如牛乳腺炎。具体菌种致病性及临床表现见表1。

表1 无绿藻与疾病表现

注：C.皮肤,M.乳腺炎,O.鹰嘴滑膜炎,S.系统感染

3 真菌形态与结构特征

无绿藻与酵母菌外形相似，呈球形、椭圆形甚至肾型，是直径3～30 μm不等的单细胞微生物。无绿藻不含细菌特有的胞壁酸及真菌特有的葡糖胺[16-17]，缺乏叶绿体，电镜下观察可见细胞壁仅两层。无绿藻进行无性繁殖，孢子囊是无绿藻属的主要结构，大约2～20个内生孢子从一个孢子囊中逐渐发育长大并随着孢子囊的破裂被动释放出来[18]。不同种类无绿藻的孢子囊直径不同[19]，大型无绿藻孢子囊直径7～14 μm，中型无绿藻7～30 μm，小型无绿藻3～10 μm。小型无绿藻的孢子囊为桑葚状，有多分隔结构，内孢子呈对称排列。其他类型无绿藻不形成多分隔结构，而是表现为随意的不规则分隔[2]。无绿藻培养适温在25～30℃之间，需氧或微需氧[20]。一般菌落形态为潮湿、灰白色乳酪样，镜下结构呈圆形或椭圆形孢子，壁厚、无菌丝及芽孢，内含特征性内孢子。

4 药物敏感性

无绿藻体外药敏实验，至今尚无美国临床实验室标准化研究所 (CLSI)的标准、质控及MIC折点，因此只能从已经发表的实验结果和数据中总结无绿藻菌对不同种类药物的敏感性。

体外药敏实验均发现无绿藻属对两性霉素B敏感[21-24]，这一结果也与临床实际治疗情况相符。Todd等[25]通过分析160例患者所接受的167种可评估治疗方案，发现静脉注射两性霉素B临床上最常用且效果最好，治疗成功率为77%；章强强等[26]报道的1例小型无绿藻所致脑膜炎病例中，使用两性霉素B治疗也获得了良好疗效。两性霉素B或其脂质体成为现今国外一线治疗无绿藻病方案之一。其次，体外药敏实验显示两性霉素B和四环素对抑制无绿藻属有协同作用[27]，临床上两药联合治疗取得成功[28]。

无绿藻对不同唑类药物敏感性不同，不同种无绿藻对同一唑类药物敏感性也有差别。在近10年的49例药敏实验结果报道，对伊曲康唑敏感的有17例，其中中型无绿藻2例[29-30]，小型无绿藻15例；对酮康唑敏感的2例，均为小型无绿藻。Linare[15]测定了104株无绿藻，显示其对伏立康唑均敏感，MIC≤0.5 μg/mL。中型无绿藻和小型无绿藻对咪康唑敏感，其他型无绿藻则未发现对咪康唑的敏感性。无绿藻对唑类药物以及多烯类药物的敏感性可能是因为其细胞膜中性脂质部分存在麦角固醇[31]，特别是小型无绿藻，麦角固醇的含量达到4%。此外，无绿藻对咪唑类的药物敏感型呈现出显著差别，细胞膜中游离脂肪酸含量的不同可能是其根本原因[2]。

抗细菌药物中，无绿藻对氨基糖苷类抗生素 (阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素)较敏感[32]。近年来国外研究者所做的药敏实验已经证实庆大霉素、卡那霉素对无绿藻的有效性[32-36]，其中庆大霉素的MIC在0.3～0.9 μg/mL之间。最近Morandi[32]报道奈替米星显示出对无绿藻良好的抑制性，实验中奈替米星对无绿藻的MIC50为12 μg/mL，MIC90为24 μg/mL,且对于不同种无绿藻的MIC均相同。乳酸链球菌肽是由乳酸乳球菌产生的一种具有广谱抗菌作用的细菌素。Morandi等[32]通过体外药敏实验发现大部分中型无绿藻菌对不同浓度的乳酸链球菌肽敏感。

虽然各种体外药敏实验结果存在差异，但综合所有实验数据，无绿藻属对于5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、磺胺类药物、β-内酰胺类抗生素、万古霉素、红霉素、氯霉素等是耐药的。

5 常用鉴定方法

无绿藻的分型鉴定主要通过直接镜检、真菌培养以及组织病理学，近年来随着分子生物技术的迅猛发展，分子生物学鉴定成为无绿藻分型鉴定的重要手段，下面分别叙述。

5.1 直接镜检

10%氢氧化钾溶液制片直接镜检，可见大量圆形、卵圆形或椭圆形孢子，大小不一，菌体透明，壁厚、无菌丝、芽孢及芽生现象，内含特征性内孢子。吴绍熙等[37]报道的由中型无绿藻引起的皮肤无绿藻病，皮损直接KOH涂片可见成团的圆形或卵圆形单壁发亮不出芽孢子，直径1.3～11 μm，有时可见多个直径为4～5 μm的内孢子。在组织病理学显示皮下结节内有大量圆形或椭圆形孢子，壁厚，内有1～8个分隔。真菌直接镜检不能区分具体种。

5.2 真菌培养

常规培养条件下，肉眼观察菌落形态呈潮湿、灰白色乳酪样。中型无绿藻菌落表面平坦，中央纽扣状，边缘皱褶；小型无绿藻最适生长温度为30℃，菌落呈半球形，边缘光滑，细胞形态和中型无绿藻相似但是更小；大型无绿藻因为产生荚膜，菌落呈黏液样，表面平坦，边缘光滑，和小型无绿藻及中型无绿藻不同，大型无绿藻在37℃不能较好生长只能在30℃生长[2]；P.blaschkeae菌落表面平坦，中央纽扣状，边缘皱褶。此外，在章强强等[26]报道的1例小型无绿藻引起的脑部感染病例中，小型无绿藻在念珠菌显色平皿 (CHROMagarCandida)上形成粉红色菌落。

5.3 组织病理学

组织病理学检查常显示不同的形态，可表现为严重的肉芽肿样坏死或无任何炎症改变。大部分为炎性肉芽肿伴坏死；各种炎性细胞、组织细胞混合浸润；角化过度及假上皮瘤样增生；局灶性角化不全；淋巴样组织增生；可在表皮或真皮乳头层中部及其他感染组织中发现孢子囊。在系统性无绿藻病中还可出现嗜酸性粒细胞增多症及胆囊、十二指肠和肝门等感染部位的纤维性变[2]。PAS染色可清晰分辨病原菌的形态与结构，也可采用Gridley真菌染色法 (Gridley fungus stain)或Grocott-Gomori六胺银改良法。无绿藻组织病理学特征为孢子囊形态:圆形、卵圆形、椭圆形，内含数个厚壁内孢子，不出芽。HE染色不明显，PAS染色明显可见。小型无绿藻感染组织病理可见到桑葚样、草莓样孢子囊，当孢子囊内有许多分隔的母细胞 (内孢子)就构成车轮状排列，而中型无绿藻无上述特点。除了常规染色，Pal等[38]通过对分离出的致病无绿藻属应用Narayan染色，成功显示出其组织形态进而鉴定。

5.4 生化特性

Arnold等[39]利用蔗糖、海藻糖、乳糖、肌糖、正丙醇、木糖等作为碳源进行碳源同化实验对无绿藻属进行鉴定。这种生长谱法结果可靠但花费时间，一般需要2周才能明确鉴别。对海藻糖的利用可以作为鉴别中型无绿藻及小型无绿藻的主要手段：小型无绿藻可利用海藻糖但不能利用正丙醇，而中型无绿藻相反。偶尔碳源来源、纯度及培养基的成分可能会给鉴定结果带来偏差。利用药敏特性也能帮助进行无绿藻鉴定：中型无绿藻对克霉唑 (50 μg)耐药，而小型无绿藻对克霉唑 (50 μg)敏感[40]；对新霉素的不同敏感性可以将大型无绿藻与中型无绿藻、小型无绿藻鉴别[41]。API 20C AUX、API 50、Vitek-2酵母鉴定系统及Rapid ID Yeast Plus test等商业化酵母鉴定试剂板可帮助鉴定菌种，但近来有实验利用经典的酵母鉴定试剂板API 20C AUX鉴定的结果与分子生物学测序结果不符，分析认为API 20CAUX可能是早年建立的数据库，覆盖的菌种库相对有限，特别是随着新的菌种及其变种或亚型不断增多，商业化酵母鉴定试剂板有一定局限性。另外利用荧光抗体技术可以检验无绿藻属的感染,但不能确定种。

5.5 分子生物学

近年来发展的分子生物学的鉴定方法可将菌株鉴定至亚种或变种[42]，且与传统真菌学检查方法相比，具有耗时短、客观、可重复性好等优点。

基因序列同源性分析法 目前真菌DNA序列分析的研究几乎都集中在核糖体DNA (rDNA)上，核糖体大亚基 (LSU)D1D2区、小亚基 (SSU)D12D2区以及核糖体内转录间隔序列ITS区在真菌核酸序列分析中，常用于真菌种水平的鉴定。其中LSU、ITS序列大小适中,因此在分类及鉴定中更为常用。2013年Hirose等[43]首次成功对小型无绿藻的ITS序列完整扩增，并发现ITS片段在不同菌种间差别较大，大小顺序是小型无绿藻>P.blaschkeae>中型无绿藻>P.cutis。朱利平、章强强等[44]通过D1/D2序列对两株无绿藻鉴定至种的水平，然而无法通过ITS序列进行鉴定，这可能是由其低覆盖率和或低相似度造成。2014年Marques等[12]优化PCR条件，通过向PCR反应中添加5%DMSO，实现了完整ITS区域的稳定扩增，对14株P.blaschkeae和18株中型无绿藻2型成功鉴定，并发现中型无绿藻2型的ITS序列长度虽然相较P.blaschkeae更短，但是种内多样性更加显著。

基于PCR的分子技术 ①PCR-SSCP:聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP)是基于PCR 的单链构象多态性分子标记技术。基本过程是:PCR扩增靶DNA；将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。2012年Cremonesi等[45]利用此技术对50个临床分离株成功进行鉴定，对18S rDNA基因的两个区域PCR产物进行分析，发现不同种菌株迁移速率存在差别，由快到慢分别是中型无绿藻基因型2>中型无绿藻基因型1>P.ulmea>P.blaschkeae>大型无绿藻。虽然PCR-SSCP技术具有快速、简单、高度重复性的优点，并可以鉴定出传统PCR方法无法鉴定的P.ulmea和大型无绿藻，但此技术对于无绿藻的鉴定也有一定局限性，例如反应对温度和pH较敏感及DNA片段长度的限制。②PCR-RFLP:PCR-限制性片段长度多态性 (Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP) 技术的原理是PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。这种方法对DNA 的量和纯度没有很高的要求，可简化图谱的带型，易于分析[46]。2008年，Aouay等[47]利用此技术对分离自患有乳腺炎奶牛的30株中型无绿藻菌进行基因分型，结果有27株为中型无绿藻基因型2，3株为中型无绿藻基因型3 (即P.blaschkeae)，结果与基因型特异性PCR鉴定结果一致。2010 年Tomasz Jagielski等[48]利用同样技术成功对分离自患有乳腺炎奶牛的44个无绿藻菌株进行分型。③两步法荧光定量PCR技术/DNA分辨率溶解曲线分析 (two step Real Time PCR reaction followed by DNA Resolution Melting Analysis):Two-stepqPCR/RMA是一种快速、高通量的鉴定方法，相比于传统的分子学鉴定更加准确、稳健、性价比高。2010年Ricchi等[49]运用此种方法成功鉴定了中型无绿藻基因型1、中型无绿藻基因型2和P.blaschkeae。然而由于全世界范围内缺乏大型无绿藻、小型无绿藻及P.ulmea的保存培养株，第二步qPCR能否用于更多无绿藻种的鉴定有待进一步实验。④RAPD-PCR:随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技术也是快速、经济、具有高分辨能力进行无绿藻鉴定的手段之一。近期，Morandi等[32]运用RAPD技术成功将意大利、巴西两地分离出的49株无绿藻进行种的分型。实验中，RAPD-PCR的重现性高于90%，使用的10个引物中，M13、OPA-4和OPA-18表现出清晰、可重复的扩增能力较适合用于鉴定，这3个单引物的Simpson指数分别为0.94、0.92和0.85，三种引物联合使用的Simpson指数为0.98。对于原核生物和真核生物，RAPD-PCR是十分实用的鉴定途径[50]，和其他分子技术的联合使用对于鉴定发现无绿藻新的基因型提供可能。⑤ISSR-PCR:ISSR (inter-simple sequence repeat)是一种基于微卫星序列发展起来的新的标记技术，简便、稳定，可以鉴定基因水平上更微小的差异。Morandi等[32]在RAPD-PCR基础上，结合ISSR技术得到了42株中型无绿藻2型间的相似系数，进一步发现同种间的分子水平差异。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都十分简单高效，很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子研究。1996年Holland等[51]首次报道运用MALDI-TOF技术对微生物进行鉴定。2012 年J.Murugaiyan等[52]应用此项技术对290株临床无绿藻菌株成功进行鉴定，并发现中型无绿藻和P.blaschkeae在3-20kDa范围内显示出特征性质谱出现高峰。J.Murugaiyan等在传统步骤上还使用了超声处理以提高质谱质量，同时建立主要光谱库 (main spectra library，MSP)将这种光谱图的可重复性进一步加强。

6 小 结

我国人口基数大、环境复杂，无绿藻病的实际发病率可能远远超过目前的文献报道数，一方面是无绿藻病临床症状缺乏特异性，另一方面对此菌的鉴定特征缺乏足够认识，导致目前无绿藻病的诊断率远低于实际感染率。随着科技发展，技术提升，深入了解无绿藻的微生物学特性，全方位探索无绿藻的鉴定方法对于了解我国无绿藻得分布与感染在流行病学具有重要意义，也能提升我国在罕见真菌病中的诊断水平与国际地位。

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