抗白色念珠菌海洋真菌的筛选及抑菌活性初探

王勇勇，蒙春蕾，蔡 爽，黄 敏，孟庆恒，孙建华

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

抗白色念珠菌海洋真菌的筛选及抑菌活性初探

王勇勇1，蒙春蕾1，蔡 爽1，黄 敏1，孟庆恒2*，孙建华2

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

实验以白色念珠菌为对象，对从渤海湾不同站位分离获得的55株海洋丝状真菌进行了抗真菌活性菌株的筛选。从中筛选得到了BH431、BH515、BH531和BH09721 4株抑菌活性较高的菌株，并进一步对不同浓度发酵液的抑菌活性及代谢物性质进行了检测。结果显示，4株海洋真菌对野生型白色念珠菌SC5314均具有较强抑菌活性，其最小抑菌浓度分别为65 g/mL、19 g/mL、54 g/mL、23 g/mL；其中BH431和BH515菌株还显示出对基因敲除型菌株RM1000的抑菌活性，最小抑菌浓度分别为32 g/mL、39 g/mL。4株海洋真菌所产生的活性代谢物具有较好的酸碱适应性，活性物质分子质量＜6 000 u；其中BH431菌株的活性代谢物还具有良好的热稳定性。

丝状海洋真菌；白色念珠菌；抑菌活性；筛选

从海洋生物中寻找新型生物活性物质和高效菌株是近年来关注的热点。已报道的天然代谢产物显示出结构新颖、活性强，开发前景好的特性[1-2]。统计数据显示，已报道的895个新型海洋微生物天然产物中有576个来源于海洋真菌[3]，这些代谢产物在抗肿瘤、抗病毒等生物活性方面有突出的表现[4-6]。尽管在海洋真菌抗菌活性的研究方面也取得了一定的进展，但多集中在抗细菌、抗放线菌活性的研究，抗真菌代谢物的研究还不多见[4]，尤其是有关抗白色念珠菌活性的研究更为少见[7-10]，而白色念珠菌不仅是一种典型的单细胞真菌，也是人畜共患的临床上的条件病原真菌[11-12]。ZHANG Y等[13]从褐藻囊藻（Colpomenia sinuosa）分离到真菌Aspergillus niger EN-13、WEN L等[14]从台湾红树林分离到真菌Paecilomyces sp.Tree1-7、HUANGZ等[15]从采自海南东寨港的红树林植物（Excoecaria agallocha）分离得到一株内生真菌Phomopsis sp.ZSU-H76、WANGW 等[16]从中国青岛晒盐场的海泥分离到耐盐真菌Alternaria raphani及LIUF等[17]从采集自中国珠海的红树植物（Kandelia candel）中分离得到一株内生真菌Talaromyces sp.ZH-154，均对白色念珠菌有一定程度的抑制活性。因此，从海洋真菌中寻找新型抗白色念珠菌活性代谢物具有其特殊的意义[18]。

据此，本研究以从渤海湾不同站位分离获得的55株海洋丝状真菌为出发菌株，以白色念珠菌为对象，进行了抗真菌活性菌株的筛选，并对筛选出的活性菌株发酵液抗白色念珠菌的效果和代谢物的性质做了初步的分析，旨在为进一步开发利用海洋来源真菌的新型抗真菌药物或先导化合物提供新的菌种来源和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株

海洋真菌：渤海湾不同站位点分离的55株丝状真菌，由天津师范大学生命科学学院微生物实验室分离保存。

靶标指示菌：白色念珠菌（Canidia albicans）野生型菌株SC5314和缺陷型菌株RM1000。

1.1.2 供试培养基

土豆培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮土豆 200 g/L；葡萄糖20 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；琼脂15 g/L；pH自然。

酵母培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母膏10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂15 g/L；pH自然。

发酵培养基：去皮土豆200 g/L（浸汁）；葡萄糖20 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH自然。

1.1.3 试剂

葡萄糖（分析纯）、MgSO4·7H2O（分析纯）：天津市化学试剂一厂；无水乙醇、盐酸：天津市化学试剂厂二厂；酵母膏、蛋白胨：北京澳博星生物技术有限责任公司；NaOH、琼脂：天津市化学试剂厂三厂。

1.2 仪器与设备

3120血球计数板：国营上海医用光学仪器厂；BL-220H电子天平：日本岛津公司；E200显微镜：日本Nikon公司；YXQG02型电热式灭菌锅：山东新华医疗器械厂；Micro 200R离心机：广州市华粤行仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱、G2X-9140MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；YX-DHS-35-420-60隔水式电热恒温培养箱：上海医疗器械七厂；UEOS-503型中空纤维膜组件、TP10-20超滤泵：天津膜天膜工程技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 靶标指示菌的培养

白色念珠菌：将保藏的白色念珠菌接入YPD斜面培养基，于26℃静置培养活化3 d，活化2代后备用。

1.3.2 海洋真菌的培养

菌种的活化培养：将保藏的菌种接入PDA斜面培养基，于26℃下静置培养5～7 d。

摇瓶培养：取经过活化的斜面菌种，用无菌水制备成1×106CFU/mL的孢子悬液，以培养基体积分数2%的孢子悬液接种于50 mL液体发酵培养基的三角瓶中，26℃、150 r/min摇瓶培养4 d。

1.3.3 海洋真菌发酵液的制备

将摇瓶培养好的发酵液经双层滤纸真空抽滤，除去菌丝球等大体积悬浮物，再用孔径为0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，得到菌种发酵原液；发酵原液经UEOS-503型中空纤维膜组件（Mr=6 000 u）进行超滤，获得分子质量大小不同的2组发酵液组分；发酵液及超滤液置于真空干燥箱制成干粉，为海洋真菌的粗提物干物质。

1.3.4 抗白色念珠菌活性菌株的筛选

菌株抑菌活性的初筛采用抑菌圈法：用无菌水将靶标菌制备成浓度为1×106CFU/mL的菌悬液，取0.1 mL置于预先倒好的平板上（Ф=9 cm），用无菌涂布棒涂匀，（培养条件如1.3.1）。取培养好的供试海洋真菌的平板，用打孔器（Ф= 8 mm）切取菌落生长均匀的部分，将切取的菌块点植接种于涂有靶标指示菌的平板，每板2～3块，菌块间距为2 cm，24 h后观察并测定抑菌圈大小。

筛选出的各菌株抑菌活性采用滤纸片法（将抑菌圈法的菌饼换为浸泡过发酵液的无菌滤纸片）对发酵液进行复筛，旨在复核确认能产生抑菌活性物质的活性菌株，排除菌体本身对靶标指示菌的影响。实验设置3个重复，结果取平均值。

1.3.5 活性菌株发酵液抑菌活性的测定

取经活化2代的靶标菌制成浓度为106CFU/mL的菌悬液，以不加靶标菌液作为对照（CK），发酵液按照2n进行梯度稀释，按表1进行加样混匀，于26℃培养12 h、24 h，在600 nm波长条件下测定吸光度值A600nm[19]。

1.3.6 活性代谢物性质的初步分析

发酵液不同组分的抑菌活性：分别检测超滤后的大分子、小分子发酵液及发酵原液的抑菌活性。

pH稳定性：用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl溶液将活性菌株发酵液分别调成pH为4、5、6、7、8、9，分别检测抑菌活性。

热稳定性：将待测菌株发酵液经45℃、56℃、70℃、80℃、90℃处理24 h、121℃高温灭菌20 min处理，以及发酵原液常温处理24 h，检测其抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 抗白色念珠菌海洋真菌的筛选

对55株渤海丝状真菌抑菌活性检测结果见表2，由表2可知，有21株海洋真菌对白色念珠菌具有较高的抑菌活性。滤纸片法复筛结果显示，4株海洋真菌BH431、BH515、BH531、BH09721对野生型菌株SC5314有较强的抑菌活性，且菌株BH431和BH515对基因缺陷型菌株RM1000有较强的抑制作用，即确定对这4株海洋真菌做进一步的分析研究。

2.2 指示菌的抑菌效果

部分海洋真菌对指示菌的抑菌效果，结果见图1。

由图1可知，4株海洋真菌对白色念珠菌SC5314及RM1000均有抑制作用。

2.3 活性菌株发酵液的抑菌活性

2.3.1 活性菌株发酵液对SC5314的抑菌活性

初筛选取对白色念珠菌SC5314抑菌活性较强的菌株BH431、BH515、BH531、BH09721做进一步分析，检测结果见图2。

由图2可以看出，菌株BH431的发酵液稀释4倍时，培养12 h，吸光度值开始上升；而培养24 h，发酵液在稀释2倍时吸光度值便开始上升，但明显低于4倍稀释液，因此，BH431菌株发酵液的最高稀释倍数为2倍。菌株BH515发酵液稀释度在1～8倍之间，培养12 h，吸光度值呈现平稳状态，当发酵液稀释16倍时，吸光度值开始上升，抑菌活性下降；而培养24 h，发酵液在稀释8倍时吸光度值便开始上升，但明显低于16倍稀释液，表明BH515菌株发酵液的最高稀释倍数为8倍。菌株BH531、BH09721的发酵液稀释度在1～4倍之间时，培养12 h，吸光度值呈现平稳状态，当发酵液稀释8倍，二者的吸光度值均开始上升；而培养24 h，发酵液稀释4倍吸光度值便开始上升，但明显低于8倍稀释液，因此，BH531、BH09721菌株发酵液的最高稀释倍数为4倍。经换算，BH515、BH431、BH531、BH09721粗提物对SC5314的最小抑菌质量浓度分别为19μg/mL、65μg/mL、54μg/mL、23μg/mL。

2.3.2 活性菌株发酵液对RM1000的抑菌活性

对基因缺陷型白色念珠菌RM1000抑菌活性较强的菌株BH515和BH431做进一步分析，检测结果见图3。

由图3可知，菌株BH515、BH431的发酵液稀释度在1～4倍时，培养12 h，吸光度值呈现平稳状态，当发酵液稀释8倍，二者的吸光度值均开始上升；而培养24 h，发酵液稀释4倍吸光度值便开始上升，但明显低于8倍稀释液。因此，BH515、BH431菌株发酵液的最高稀释倍数均为4倍，经换算，BH515、BH431粗提物对RM1000的最小抑菌浓度分别为39μg/mL、32μg/mL。

2.4 活性菌株发酵液不同组分抑菌活性的分析

发酵液经UEOS-503型中空纤维膜组件（Mr=6 000 u）进行超滤后得到大分子组分（Mr＞6 000 u）和小分子组分（Mr＜6 000 u），分别进行抑菌活性检测，结果见表3。

由表3可知，4株海洋真菌发酵液小分子组分和发酵原液抑菌活性较明显，发酵液中截留的大分子物质抑菌活性显著下降或几乎没有抑菌活性。结果表明，4株海洋真菌抑菌活性组分主要为发酵液小分子组分。

2.5 pH对活性菌株发酵液抑菌活性的影响

活性菌株发酵液分别调成pH值为4、5、6、7、8、9，分别检测抑菌活性，结果见表4。

由表4可知，4株海洋真菌在设定的pH范围内，其发酵液均表现出抑菌活性，这一结果显示，pH值变化对发酵液的抑菌活性影响不大，表现出较好的酸碱适应性。且BH431菌株对SC5314的抑菌效果差异不显著（P＞0.05）。

2.6 发酵液的热稳定性

将待测菌株发酵液经45℃、56℃、70℃、80℃、90℃处理24 h、121℃高温灭菌20 min，以及发酵原液（常温24 h），检测其抑菌活性，结果见表5。

由表5可知，菌株BH431的发酵液对白色念珠菌的抑菌活性受温度影响差异不显著（P＞0.05），具有较好的热稳定性；菌株BH09721、BH531、BH515的发酵液具有一定的耐热性，但经80℃以上高温处理丧失了抑菌活性，即失活。

3 结论

本研究从渤海湾水域分离获得的55株海洋丝状真菌中筛选出抗白色念珠菌活性显著的菌株BH515、BH431、BH531、BH09721，并对其进行了初步的分析研究。其中海洋真菌BH431和BH515不仅对野生型白色念珠菌SC5314有抑制作用，对基因缺陷型菌株RM1000也有较强的抑制作用，已有报道表明，菌株RM1000丧失了合成组氨酸的功能[20]，基因类型为ura3：：imm434/ura3：：imm434 iro1/ iro1：：imm434 his1：：hisG/his1：：hisG[21-22]，而菌株SC5314能正常合成组氨酸，其具体作用机制有待进一步研究。已有报道显示，菌株BH431还具有较强的杀线活性[23]和抑大肠杆菌活性[24]的功能，且其菌种发酵液具有较广泛的酸碱适应范围及耐高温特性，显示出菌株BH431相对广泛的生物活性，具有可观的研究前景。

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Screening of anti-Canidia albicans marine fungi and their antifungl activity

WANGYongyong1,MENG Chunlei1,CAIShuang1,HUANG Min1,MENGQingheng2*,SUN Jianhua2

(1.College of Life Science,Tianjin NormalUniversity,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin NormalUniversity,Tianjin 300387,China)

Using Candida albicans as the target strain,antifungal strains were screened from fifty-five marine-derived filamentous isolated from differentsites in Bohai Bay.Four strains of BH431,BH515,BH531 and BH09721 which had higher anti-C.albicans activity were screened,and the antifungal activity of the fermentation broth and the character ofmetabolite were preliminary tested.The results showed that the four strains had higher antifungalactivities to the wild type C.albicans SC5314.Their minimalinhibitory concentration(MIC)was 65 g/ml,19 g/ml,54 g/mland 23 g/ml, respectively.Whereas,strains BH431 and BH515 possessed antifungalactivity to the knockoutstrain RM1000 with MIC 32 g/mland 39 g/ml.Moreover,their active metabolites also showed adaptability in a wide range of pH.The ultrafiltration results suggested that the molecular mass(Mr)was less than 6 000 u.Extensively,the active metabolite of BH431 strain showed an excellentthermostability.

marine-derived filamentous fungi;Canidia albicans;antifungalactivity;screening

Q939.9

A

0254-5071（2015）02-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.013

2014-12-12

国家自然科学基金资助项目（31272019）

王勇勇（1987-），女，硕士研究生，研究方向为应用微生物。

*通讯作者：孟庆恒（1963-），男，副教授，硕士，研究方向为应用微生物。