宏基因组学在木聚糖酶制剂基因新资源开发中的应用

熊 科，杨玉焕，李秀婷*

（1.食品质量与安全北京实验室，北京 100048；2.北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；3.北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048）

宏基因组学在木聚糖酶制剂基因新资源开发中的应用

熊 科1，2，杨玉焕1，2，李秀婷1，3*

（1.食品质量与安全北京实验室，北京 100048；2.北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；3.北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048）

木聚糖酶是一种重要的工业酶制剂，其来源主要是从多种生物体，尤其是微生物体中通过培养分离得到的。目前通过常规培养手段只能获取自然界约1%的微生物木聚糖酶基因资源，使得优良木聚糖酶制剂的开发遭遇限制瓶颈。而宏基因组学研究通过提取环境中的大量微生物基因组DNA、构建文库并对文库进行筛选寻找，它突破了传统微生物产木聚糖纯培养方法的局限，使得从环境中获得大量非培养的99%的微生物基因资源成为现实，极大地扩展了微生物产木聚糖酶资源的利用空间。宏基因组学在开发具有工业应用价值的优良木聚糖酶基因方面具有独特优势，综述了宏基因组学文库的构建、筛选方法以及其在木聚糖酶基因资源开发应用的情况。

宏基因组学；构建；筛选；木聚糖酶；新基因资源

木聚糖酶是能够催化水解木聚糖的一类在食品工业中有广泛应用的酶制剂。目前在食品、酿酒、饲料和造纸行业被广泛应用的不同类型和功能的木聚糖酶制剂基本都是从多种生物体中培养分离得到的。

目前，木聚糖酶制剂的生产主要由微生物发酵生产制备，其中包括细菌、丝状真菌及放线菌等。这种依靠培养微生物发酵生产木聚糖酶制剂的传统常规手段获得的微生物木聚糖酶资源只占环境中不到1%的木聚糖微生物资源，99%以上的非培养的木聚糖酶微生物资源都无法在现有条件下进行培养筛选获得，这样就损失了大量的微生物物种多样性，尤其是一些具有优良性质的环境微生物木聚糖酶来源，在常规条件下无法进行人工的培养并使其稳定产酶。所以，寻找一种能够克服传统常规筛选培养技术的不足的研究手段是探知非培养木聚糖酶微生物，扩大寻找木聚糖酶制剂基因资源的必要条件。而利用宏基因组学的方法可以获得某一环境中所有微生物的基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、然后以此为基础构建基因组文库并对文库进行筛选，大大提高了寻找和发现优良性状木聚糖酶基因资源的概率，在木聚糖酶制剂工业生产上具有较大价值。

宏基因组学是通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库并对文库进行筛选，寻找和发现新基因资源的一种方法，它绕过了微生物分离培养过程，成为研究环境样品中不可培养微生物的有力手段，在开发具有重要工业应用价值的木聚糖酶基因方面具有独特优势。为此，人们正在研究如何利用这一技术解决高效筛选未知来源的食品工业酶制剂基因资源[1]，并在异源宿主中成功表达的新研究策略[2]。本文综述了宏基因组学的概念、宏基因文库的构建、筛选方法以及其在开发木聚糖酶基因研究中的应用情况。

1985年，PACE N R等[3]首次提出可以通过直接从环境样品中提取微生物的群体基因组DNA，绕过纯培养技术直接对其进行研究，并成功获得了大量前所未知的微生物信息。1998年，HANDELSMAN J等[4]正式提出了宏基因组（metagenone）概念，定义为“生物环境中全部微小生物的基因组”（the genomes of the totalmicrobiota found in nature）。它包含了可培养和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

1 宏基因组学的研究过程

宏基因组学的研究过程与基因组学相似，一般包括：（1）从环境样品中提取宏基因组DNA；（2）将DNA片段连接到合适的载体上；（3）将载体转化到宿主细菌，建立宏基因组文库；（4）对宏基因组文库进行分析与筛选（见图1）。宏基因组学与基因组学的主要区别：（1）研究对象的复杂性不同，宏基因组学的研究对象是环境样品的宏基因组DNA，而基因组学的研究对象是某一种生物的基因组，前者比后者复杂，环境样品的微生物多样性越丰富，前者越复杂；（2）研究目标不同，前者要测定由多种微生物组成的复杂群体（community）的混合基因组序列，而后者通常是测定单一物种的基因组序列。

2 宏基因组文库的构建

目前，构建宏基因组学文库常用的为载体克隆文库。载体克隆文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括样品总DNA的提取、与载体连接和克隆到宿主中。

2.1 样品总DNA的提取和纯化

环境样品DNA的提取是文库构建中最重要、最关键的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来，还要保证一定的DNA片段长度、完整性以及纯度。另外，环境样品中都含有一些可抑制分子克隆中多种酶活性的杂质（如土壤中的腐殖酸类物质），这些物质也必须除去。DNA提取方法的选择[5-6]非常重要，不同土样、不同提取方法所提DNA的量和片段大小及完整性会有很大不同。由于土壤微生物与其他组分结合紧密，所以提取土壤DNA的难度很大[7]。

根据提取样品总DNA前是否需分离细胞，可将提取方法分为原位裂解法和异位裂解法[8]。原位裂解法又称直接法，是将土样直接悬浮在裂解缓冲液中处理，然后抽提纯化。此法操作简单，成本低、DNA提取率高，但由于机械剪切作用较强，所提DNA片段较小（1～50 kb），且腐殖酸类物质也难以彻底去除。该法通常适用于构建小片段插入文库（质粒或λ噬菌体为载体）的DNA提取[9]。异位裂解法又称间接法，是先采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，此法可获得大片段DNA（20～500 kb），且所提DNA纯度较高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能会丢失，且温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA抽提不出来。该法通常适用于构建大片段插入文库（柯斯质粒或者细菌人工载体为载体）的DNA提取[6]。

2.2 载体的选择

目的基因能否被有效转入宿主细胞，并在其中高效表达，在很大程度上取决于载体[10]。载体系统的选择取决于目的基因的扩增和表达，提高和调控外源基因的拷贝数和表达量[11]。用于构建宏基因组文库的载体很多，大致可分为质粒载体系列、噬菌体系列如早期的λ噬菌体、黏粒（cosmid）、P1噬菌体和F黏粒（fosmid）等和人工染色体系列如酵母人工染色体（yeast artificialchromosome，YAC）、细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）和P1派生人工染色体（P1-derived artificialchromosome，PAC）等[12]。常用的载体为柯斯质粒（cosmid）和BAC，前者允许插入片段的长度为25～35 kbp，后者约200 kbp。

2.3 宿主菌株的选择

选择适宜的宿主细胞是重组基因高效克隆或表达的重要条件。目前，常用宿主菌株是大肠杆菌（Escherichia coli）、链霉菌属（Streptomyces）或假单胞菌属（Pseudomonas）。一些缺陷型突变体也可以作为以功能驱动为筛选方法的宏基因组文库的宿主菌株。宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状（如抗药性和缺陷型），以及是否对异源表达基因产物有较强的相容性等因素。原核基因的表达一般选用大肠杆菌作为宿主，而宏基因组DNA中也含有真核基因，故以真核生物如酵母菌属（Saccharomyces sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）作为宿主。

2.4 载体克隆文库的筛选

构建载体克隆是研究未养微生物，寻找新功能基因和开发获得新活性物质的重要新途径[13]。目前，载体克隆文库筛选方法大致可分为五类：（1）序列驱动筛选法；（2）功能驱动筛选法；（3）底物诱导基因表达法；（4）稳定性同位素技术筛选法；（5）荧光原位杂交技术筛选法。

2.4.1 序列驱动筛选法

序列筛选法根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆，它是基于基因的序列特征，通过核酸杂交寻找目的基因或直接对目的基因进行扩增，在一定程度上克服了功能驱动筛选法需要表达产物的缺点。

2.4.2 功能驱动筛选法

功能筛选法是依据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。功能驱动筛选不必依赖已知的基因信息，因此可能得到新的基因和产物；但其受制于外源基因在宿主细胞中的表达，且因检测手段局限，筛选工作量大、效率低，往往分析大量克隆却仅有几个具有活性[14-15]。因此，在实际工作中，序列驱动和功能驱动可以结合使用。

2.4.3 底物诱导基因表达法

底物诱导基因表达筛选（substrate-induced gene ex pression screening，SIGEX）是利用代谢相关基因或酶基因通常在有底物诱导的条件下才表达的原理进行筛选目的基因。底物诱导基因表达筛选用于检测能利用各种底物诱导的分解代谢型基因，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因[16]。SIGEX筛选技术是一种高通量的筛选方法，不需要对底物进行修饰，快速经济，半自动化操作省时省力，适用于分离序列未知的新基因，可以检测新型分解代谢型基因。SIGEX技术虽然能增强宏基因组文库外源基因的表达能力，但是它也有其缺点：不能筛选组成型基因；对基因的结构与表达方向敏感，当目的基因与转录调控元件在基因组上相距较远时，将不能被筛选到[17]；当活性克隆在目的基因和GFP基因之间有一个转录终止子时因不表达GFP而无法被流式细胞仪分析（flow cytometry analysis，FCAS）筛选到[16]。

2.4.4 稳定性同位素技术筛选法

具有相同原子序数、不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素（stable isotope probing，SIP）。随着稳定性同位素技术与分子生物学技术的结合及发展，SIP技术可以用于鉴定和分析复杂样品中具有特定代谢功能的微生物。稳定性同位素技术筛选法可以对环境中某种活性微生物的核酸进行富集，进而构建一个吸收了特定基质而又执行特定代谢功能的微生物宏基因组文库，极大地减少需要筛选的克隆数量[18]。

2.4.5 荧光原位杂交技术筛选法

荧光原位杂交（fluorescentin situ hybridization，FISH）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下进行定量分析，以检测特异微生物种群的存在与丰度。FISH技术可以进行样品的原位杂交，已经广泛用于分子微生物生态领域。FISH技术已经用于不同生态系统的研究中，应用稳定同位素技术可以对环境中某些活性微生物的核酸进行富集，进而构建宏基因组文库，对于寻找未培养微生物的功能基因非常有利[19]。

3 宏基因组学在木聚糖酶基因资源研究中的应用

微生物来源的木聚糖酶由于其有良好的特性而在工业和农业上具有很大的应用潜力，因而被广泛研究。表1为近年来国内外利用宏基因组学筛选到新木聚糖酶的研究状况。目前多数的木聚糖酶是来源于各类原始菌株的发酵产生，原始菌株产生的木聚糖酶优势在于其产生的是复合酶，对木聚糖的作用更为彻底。当然，运用基因工程手段来获得木聚糖酶的研究越来越多，木聚糖酶基因在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等宿主中均有获得表达，尤其是那些来自极端环境微生物的木聚糖酶，在日常条件下很难人为的培养并使其产酶，但通过基因工程的手段可以获得目的基因并进行异源表达，在生产上具有很大价值，但是基因工程菌所表达的木聚糖酶较为单一，且与已知菌所产的木聚糖酶的同源性较高，很难获得与常规木聚糖酶性质相差较大、新颖性较好的木聚糖酶。而利用宏基因组学的方法可以获得某一环境中所有微生物的基因组DNA、然后构建基因组文库并对文库进行筛选，大大提高了寻找和发现新的木聚糖酶基因的概率。利用宏基因组学筛选木聚糖酶新资源已经开始成为筛选研究的热点方向。

近年来国内外利用宏基因组学筛选到的木聚糖酶中，MO X C等[28]构建了含约12 000个克隆子的水稻秸秆降解富集培养物的宏基因组文库，从中筛选到一个新的木聚糖酶基因umxyn10A，将其导入大肠杆菌中异源表达，重组木聚糖酶Umxyn10A最适反应温度是75℃，最适反应pH值是6.5，在65℃以下稳定，酶活剩余80%以上，大多数的金属离子几乎都不会降低其酶活力，该木聚糖酶是对桦木木聚糖比较敏感的β-1,4-内切木聚糖酶，具有较宽的底物特异性，能够有效降解各种组分中含有的杂聚木聚糖，是一种多功能酶。此外，重组木聚糖酶Umxyn10A能够彻底地将低聚木糖水解为木二糖或者木二糖和木糖的混合物，因此最终产物木二糖不会抑制重组木聚糖酶Umxyn10A的酶活力。二糖对人体健康和营养有益，OKAZAKIM等[29]发现木二糖是对维持人体肠道菌群有益的双歧杆菌的选择性生长刺激物。DEGNANBA等[30]研究表明，木二糖对双歧杆菌的作用效果比其他低聚糖的作用效果好。而JIANG Z Q 等[31]研究表明，木二糖的生产成本很高，因此，利用木聚糖酶Umxyn10A制备木二糖具有应用潜力。CHENG F S等[32]从黑白花牛瘤胃宏基因组文库中获得的木聚糖酶Xyln-SH1在单独存在并且高剂量2 000 U的条件下能够有效提高小麦秆释放阿魏酸的含量即每100 g小麦秆释放（57.94±5.52）mg阿魏酸，Xyln-SH1的这种特性在生物降解和工业应用上具有很大潜力。NACKE H等[33]构建了3种大片段的牧场土壤基因组文库，功能驱动筛选到1个新的纤维素酶基因cel01 和2个新的木聚糖酶基因xyn01和xyn02，它们对应的酶在较宽的温度和pH范围内具有较高的酶活，特别是纤维素酶Cel01具有高酶活、pH稳定以及较高的耐盐性，具有工业应用价值。

4 结束语

利用宏基因组技术筛选新型木聚糖酶制剂基因资源是一种效率高、具有广阔前景的筛选方法。环境微生物总体是一个巨大的基因资源库，而现有的传统培养技术仅仅能对其中小部分微生物基因资源进行探索，而宏基因组技术则可发掘环境中潜在生物催化剂。利用宏基因组技术从文库中开发出高效催化及各类优良性质的木聚糖酶制剂，将进一步拓展该类酶制剂在食品工业、医药业、饲料、造纸等领域的广泛应用。

虽然宏基基因组技术具有广阔前景，但作为一种新兴的技术手段，但宏基因组学技术并非完美无缺，还存在着一些问题有待解决。例如，基于功能的序列筛选和基于序列PCR的方法均属于宏基因组技术。二者的共同优点是无需依赖微生物的纯培养；缺点是土壤基因组DNA提取过程中会有部分基因序列丢失。同时宏基因技术筛选工作量大，效率低，并且易受检测手段的局限。在宏基因组DNA的提取方面已经取得了一些成果，但是在宏基因组文库的高通量筛选方面仍存在一定的难度，文库的构建以及载体和感受态细胞的选择都直接影响对文库的筛选率，而序列驱动筛选虽然获得了大量不同种属蛋白酶的片段，但较难获得木聚糖酶基因全长。因而根据不同的研究目的，选择不同的文库构建方法和筛选方法会比较成功获得木聚糖酶基因。这些都仍需科研工作者对其进行不懈地深入发展和广泛应用，使其能够更为有效地用于探索新的微生物资源。

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Application of metagenomics in novel xylanase genes development

XIONG Ke1,2,YANGYuhuan1,2,LIXiuting1,3*

(1.BeijingLaboratoryofFoodQualityandSafety,Beijing100048,China; 2.BeijingHigherInstitutionEngineeringResearchCenterofFoodAdditivesandIngredients,Beijing100048,China; 3.BeijingKeyLaboratoryofFlavorChemistryBeijingTechnologyandBusinessUniversity(BTBU),Beijing100048,China)

Xylanase is an important industrial enzyme.It mainly originates from a variety of organisms,especially from microorganisms isolated by cultivation.Through conventionalmeans ofcultivation can only exploitabout1%xylanase genes resources of microbes in nature,making excellent xylanase enzyme encounters limiting bottleneck.Metagenomics is an advanced methodology on extracting allmicrobialgenomic DNAs directly from environmentalsamples,constructing and screening metagenomic libraries to seek novelgenes and bioactive compounds.This methodology has broken the limitation of the traditional microbe cultivation,and geta lotof 99%uncultured microbialgenes from certain environment,greatly broaden the space of microbial resource utilization.The unique advantage of metagenomics is developing functionalgenes which have importantapplication value in sociallife.This paper reviewed the conceptofmetagenomics and the library construction,meanwhile,discussed the gene screening methods and the applications ofmetagenomics in developmentof novelxylanase genes.

metagenomics;construction;screening;xylanase;novelgene resources

Q819

A

0254-5071（2015）02-0001-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.001

2015-01-06

国家自然科学基金资助项目（31371723）；北京市自然科学基金（5144026）；食品科学创新团队（IDHT20130506）

熊 科（1981-），男，讲师，博士，研究方向为食品生物化学。

*通讯作者：李秀婷（1970-），女，教授，博士，研究方向为微生物与酶工程。