长枝木霉原生质体制备及再生条件研究

丁 苏，李 献，李 玮，毕方方，林 玲，韦俏娜，张 瑛

（1.广西大学行健文理学院，广西南宁530004；2.广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007）

长枝木霉原生质体制备及再生条件研究

丁 苏1，李 献1，李 玮2，毕方方1，林 玲2，韦俏娜1，张 瑛2*

（1.广西大学行健文理学院，广西南宁530004；2.广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007）

研究优化了长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15菌株菌丝体制备原生质体细胞及再生的条件。通过单因素试验和正交试验对影响原生质体形成和再生的菌龄、破壁酶组成、酶解反应温度及时间、渗透压稳定剂等因素进行了筛选优化。结果表明，长枝木霉菌株JK-15的最适条件为菌丝体菌龄18 h，混合酶组成配比为1.5%蜗牛酶∶1.5%纤维素酶∶0.1%溶壁酶，酶解条件为30℃条件下酶解2.5 h，原生质体制备过程中渗透压稳定剂为0.7 mol/L山梨醇，原生质体再生培养基中渗透压稳定剂为0.7 mol/L蔗糖，实验结果为长枝木霉JK-15的育种工作奠定了良好的技术基础。

长枝木霉；原生质体；生物防治；育种

木霉（Trichodermaspp.）是一类具有较强生物防治功效的丝状真菌，其具有生长迅速、能分泌多种抑菌物质、能够对植物病原菌进行重寄生等生理特性，因而在国内外被广泛的用于多种植物病害的生物防治研究[1-3]。但在实际的农业生产应用过程中，大多数木霉菌均会表现出最适温度区间较小、定殖能力不稳定、抑菌广谱性较差等不足。为了解决这些问题，研究人员一方面不断努力从自然界中筛选更优良的野生菌株，另一方面也在尝试通过微生物育种的方法改良现有菌株[4-7]。通过制备木霉的原生质体，进而进行诱变或融合，是对木霉菌株进行改良选育的有效手段[8-9]。

目前国内外关于长枝木霉原生质体制备的方法报道较少，在前期研究中，本课题组从自然环境中筛选获得了对葡萄灰霉病和溃疡病具有较好生物防治效果的野生长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15，但因其表现出对高温耐受较差的缺点，不利于在广西等我国南部地区的实际应用，因此，本研究通过原生质体育种的方法，对该菌进行改良，对长枝木霉JK-15的原生质体制备及再生条件进行研究，为今后的原生质体育种工作奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15，由广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所筛选并保藏。

1.1.2 培养基

斜面及平板培养采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，去离子水1 000 mL，pH自然。

菌丝体培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，MgSO45 g，KH2PO45 g，去离子水1 000 mL，pH自然。

1.1.3试剂及溶液

蜗牛酶（10 U/mg）：福建漳州金田生物科技有限公司；纤维素酶（CAS9012-54-8，10U/mg）、β-巯基乙醇（分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司；溶壁酶（CAS158928，10000U/mL）：德国Qiagen公司；NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（0.2mol/L，pH5.7）的配制：NaH2PO42.917g，Na2HPO40.466g，去离子水100 mL。

渗透压稳定液：用PBS缓冲液分别配制0.7mol/L NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇的渗透压稳定液。

菌丝前处理液：含体积分数0.1%β-巯基乙醇的20 mmol/L EDTA溶液。

酶溶液：用渗透压稳定液配制蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶的单一组分酶溶液或混合酶溶液，于常温下令酶粉或酶液充分混匀后，4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm无菌微孔过滤器过滤除菌。

1.2 仪器与设备

EBA21型高速离心机：德国Hettich Zentrifugen公司；J2-21高速冷冻离心机：美国Bechman公司；ILB-008-04低温恒温循环器：施都凯仪器（上海）有限公司；SPX-250型生化培养箱：上海跃进医疗仪器厂；HVE-50自动灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；SKY-211B振荡培养箱：上海苏坤仪器设备有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；OLYMPUS CX41光学显微镜：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将保藏的长枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理盐水洗下制备成浓度为105个/mL的单孢子悬浮液，稀释涂布于PDA平板上，30℃培养36 h，挑取生长迅速、表面长满绿色孢子的单菌落接种于PDA斜面上，30℃培养3 d，至斜面培养基表面长满。

1.3.2 菌丝体的培养

将活化培养获得的长枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理盐水洗下制备成浓度为105CFU/mL的单孢子悬浮液，按10%（V/V）的接种量接种于盛有100 mL菌丝体培养基的500 mL三角瓶中，160 r/min振荡培养适宜的时间后，用4层擦镜纸过滤收集菌丝体用于制备原生质体。

1.3.3 原生质体的制备与再生

将收集的菌丝体用PBS缓冲液和无菌水依次洗涤3次，重悬浮于菌丝前处理液中，处理一定时间后，用渗透压稳定液洗涤3次，收集菌丝体重悬浮于酶液中，于100 r/min振荡酶解制备原生质体。酶解结束后用4层擦镜纸过滤，收集滤液，4 000 r/min离心10 min，收集原生质体沉淀，重悬浮于渗透压稳定液中，用血球计数板进行计数，随后用渗透压稳定液进行梯度稀释涂布于高渗平板（在普通平板中添加渗透压稳定剂）和普通平板上，于30℃培养72 h，统计平板上单菌落数量，用以下公式计算原生质体再生率：

式中：A为高渗平板上生长的单菌落数，CFU/mL；B为普通平板上生长的单菌落数，CFU/mL；C为显微镜下观察到的原生质体数，CFU/mL。

2 结果与分析

2.1 破壁酶液组分优化

由于不同微生物的细胞壁组成结构差异较大，因而在制备原生质体时所选择的破壁酶的种类、用量及配比也随之存在较大差别[10-13]，需要根据实际情况进行选择优化。本实验中选择制备丝状真菌原生质体常用的蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶配制混合酶液，以原生质体生成量作为考察指标，通过正交试验确定最适的组合条件。正交试验结果及分析见表1，方差分析见表2。

由表1可知，混合酶3个组分对长枝木霉原生质体制备影响大小顺序为纤维素酶＞溶壁酶＞蜗牛酶，最优化混合酶配比为A3B3C1，即1.5%蜗牛酶，1.5%纤维素酶，0.1%溶壁酶。验证试验结果表明，该配比条件下酶解生成原生质体的数量为（9.8±0.2）×106CFU/mL。

由表2可知，蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶对原生质体生成量影响均显著（P＜0.05）。

在此基础上，同时选择了4组生成原生质体效果最优的酶组合，考察其制备所得原生质体的再生率，结果如图1所示。由图1可知，A3B3C1混合酶配比条件下，既能获得较高的原生质体制备效率，又能保持较好的再生率，因而将A3B3C1混合酶配比确定为后续工作的混合酶配比方案。

2.2 菌丝体培养时间的确定

菌丝体的菌龄对于细胞壁结构、原生质体的生成效率及活力影响显著。菌龄过长易造成细胞壁结构变厚不得于原生质体的释放；菌龄过短菌丝易断裂，不利于原生质体与菌丝体的分离。丝状真菌往往选择处于生长旺盛期的细嫩菌丝用于制备原生质体。由图2A可知，原生质体的生成数量随菌丝体菌龄而增加，至菌龄达到18 h后原生质体的生成量开始下降；由图2B可知，菌龄18 h的菌丝体制备得到的原生质体再生率也最高。因此，选择18 h为长枝木霉JK-15制备原生质体的最适菌龄。

2.3 最适酶解温度与时间的确定

不同酶解温度及酶解时间条件下原生质体生成曲线如图3所示。过高或过低的酶解温度会影响原生质体的生成速度和最终的制备效率；而原生质体的生成量与酶解的反应时间呈正比，但过长的反应时间会使已生成的原生质体细胞被破坏死亡，从而降低制备效率。由图3可知，，长枝木霉JK-15原生质体酶解的最适温度为30℃，最适酶解反应时间为2.5～3.0 h。在此基础上，分别测定了30℃酶解2.5 h、3.0 h、3.5 h制备所得原生质体的再生率，分别为19.6%、16.7%和12.3%，综合考虑原生质体的生成量和再生率，确定在30℃下酶解2.5 h为酶解反应的最适条件。

2.4 渗透压稳定剂对于原生质体制备与再生的影响

渗透压稳定剂的作用是维持原生质体正常形态[14-15]，其不仅影响原生质体的制备效率，同时影响原生质体的再生率。不同微生物在制备原生质体过程中，适宜的渗透压稳定剂差异较大，需要通过试验进行筛选。本研究添加0.7 mol/L NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透压稳定液，分别考察其对原生质体生成量及再生率的影响，结果见图4。由图4可知，对于原生质体制备和再生效果最好的稳定剂分别为山梨醇和蔗糖，因此在制备原生质体时应使用0.7 mol/L山梨醇为稳定剂，而在再生培养基中应使用0.7 mol/L蔗糖作为稳定剂。

3 结论

原生质体的制备与再生是微生物原生质体融合、原生质体诱变以及基因组重组等育种过程中的关键性环节。能够在高效制备原生质体的前提下实现较高的原生质体再生率对于育种工作的效率与结果至关重要。本研究通过一系列的条件优化，最终确定了长枝木霉JK-15最适的原生质体制备及再生条件为：菌丝体菌龄18 h；混合酶组成配比为1.5%蜗牛酶：1.5%纤维素酶：0.1%溶壁酶；酶解温度30℃，酶解时间2.5 h；原生质体制备过程中渗透压稳定剂为0.7 mol/L山梨醇，原生质体再生培养基中渗透压稳定剂为0.7 mol/L蔗糖。本研究的结果为长枝木霉JK-15的育种工作奠定了良好的技术基础，同时为其他长枝木霉菌株原生质体的制备工作提供了参考。

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Optimization ofTrichoderma longibrachiatumprotoplasts preparation and regeneration conditions

DING Su1,LI Xian1,LI Wei2,BI Fangfang1,LIN ling2,WEI Qiaona1,ZHANG Ying2*
(1.Xingjian College of Science and Liberal Arts,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China)

The protoplasts preparation and regeneration conditions ofTrichoderma longibrachiatumJK-15 were studied.The effect of mycelia growth time,enzyme composition,enzymatic reaction temperature and time,osmotic pressure stabilizer on protoplasts formation and regeneration were optimized by single factor experiments and orthogonal experiments.The results showed the optimal conditions were mycelia growth time 18 h,enzyme composition snailase 1.5%,cellulose 1.5%and lytic enzyme 0.1%;enzymatic reaction was carried out at 30℃for 2.5 h,the optimal osmotic pressure stabilizers in protoplast preparation process and protoplast regeneration process were sorbitol 0.7 mol/L and sucrose 0.7 mol/L,respectively.The research has laid a good working basis for further breeding ofT.longibrachiatumJK-15.

Trichoderma longibrachiatum;protoplast;biological control;breeding

Q939.96

A

0254-5071（2015）06-0058-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.013

2015-05-20

广西自然科学基金（2014GXNSFAA118107）；广西大学行建文理学院科研基金（2013ZKLX03）

丁苏（1985-），女，讲师，硕士，研究方向为微生物工程。

*通讯作者：张瑛（1974-），女，研究员，硕士，研究方向为葡萄育种及病虫害防治。