iTRAQ技术在阿尔茨海默病早期诊断中的应用



iTRAQ技术在阿尔茨海默病早期诊断中的应用

曾九江田立兵白帅魏楚蓉毛慕华罗友根

(井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心，江西吉安343000)

〔关键词〕阿尔茨海默病；iTRAQ；蛋白组学；早期诊断

第一作者：曾九江(1991-)，男，主要从事神经损伤修复研究。

迄今为止，阿尔茨海默病(AD)的病因和发病机制尚不明确，目前尚无有效治疗措施，所以AD的早期诊断显得尤为重要。结合多维液相色谱和串联质谱分析，相对和绝对定量的等量异位标签技术(iTRAQ)现已成为蛋白组学定量研究的主要工具之一。它能够精确筛选和鉴定病理状态下差异表达蛋白并分析其功能，从而明确疾病的病因和发病机制并对疾病做出早期诊断。本文就iTRAQ技术在AD早期诊断中的应用作一概述。

1iTRAQ技术原理

iTRAQ试剂为能与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同种元素，由4种分子量均为145 D的等量异位标签分子组成。 标签分子分别由质量为 114、115、116、117 Da的报道基团、质量为31、30、29、28 D的质量平衡臂和一个相同的多肽反应基团组成〔1〕。报告部分 有4种(114～117)，因此iTRAQ可同时标记4组样品，现在该试剂已经发展到可以同时标记8种不同蛋白质样品,分析能力明显提高。平衡部分可保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同。肽反应部分能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接，可标记所有酶解肽段。

iTRAQ标记和分析过程：将4种蛋白质样品分别进行还原和烷基化，经胰蛋白酶水解后，分别用4种不同的iTRAQ试剂进行标记，将所有样品混合，然后经非在线或在线的液相分离，并用串联质谱方法对在第一级质谱检测到的前体离子进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。第二级质谱可同时检测到质量相差1 D的114、115、116和117 D 4种报道离子和被标记多肽肽键断裂产生的离子串。前者代表不同样品中相同多肽的丰度，而后者可通过对蛋白质序列数据库的搜索确定蛋白质前体的身份。在其上4 种报告基团通过平衡基团与反应基团相连，几乎可以标记所有蛋白质〔2,3〕。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比，而且信号离子表现为不同质荷比(114～117)的峰，并根据波峰的高度及面积，获取蛋白质的定量信息。

2iTRAQ技术在AD早期诊断中的应用

2.1定量分析神经细丝神经细丝(NF)是神经细胞骨架之一，由三种多肽亚基组成：NF-L(73 kD)、NF-M(145 kD)、 NF-H(200 kD)。神经骨架蛋白的异常磷酸化是AD的一个早期的病理生理特征。iTRAQ分析报道，与正常脑相比，AD脑中NF-M Ser-783位点的磷酸化水平显著升高。另外，用磷酸化的Ser-680 和Ser-685来标示人类NF-M的肽残基，与正常脑相比，iTRAQ试剂标记在AD脑上的相对强度达到高峰值，表明AD脑中NF-M的Ser-685位点磷酸化水平也升高〔4〕。采用iTRAQ技术对AD脑NF-H磷酸肽进行鉴定和定量分析，结果发现AD脑中NF-H有10个KSP位点存在高水平的磷酸化(磷酸化水平为对照组的2.31～8.01倍)，并通过iTRAQ分析认为细胞周期素依赖蛋白激酶5(Cdk5)是AD脑中NF-H高度磷酸化的主要激酶〔4〕。总之，iTRAQ分析显示AD脑中的神经纤丝NF-M 和 NF-H比正常脑磷酸化水平更高，这是首次运用定量技术来鉴定多部位高度磷酸化的蛋白。这种对NF-M 和 NF-H磷酸化部位进行iTRAQ定量分析对AD早期诊断具有重要意义。

2.2定量分析Aβ前体蛋白APPβ淀粉样蛋白(Aβ)是淀粉样蛋白前体(APP)经蛋白水解酶水解后的产物，是AD脑内主要病理标志性蛋白之一。有研究报道，3×Tg AD鼠存在Aβ沉积，并采用iTRAQ方法定量分析了16月龄的3×Tg AD鼠脑内蛋白的差异表达，发现APP突变基因高度表达〔5〕。也有研究认为，APP突变的转基因模式动物在Aβ形成前，已经有许多蛋白的表达发生变化，大部分蛋白在学习和记忆中有重要的作用，表明APP基因突变使其它许多蛋白表达发生变化，最终导致老年斑的形成，认知功能下降〔6〕。这些数据为AD的早期诊断提供强有力的证据。

2.3定量分析N-糖蛋白N-糖蛋白的糖基化与AD密切相关。iTRAQ技术结合18O稳定同位素鉴定N-糖基化位点，定量糖基化肽类和非糖基化的肽类，并且在目标糖蛋白中获得N-糖基化位点比率。再用H216O和H218O分别标记经过肽-N-聚糖酶F催化的N-糖基化位点，结果肽裂解碎片使标记的肽和相应的蛋白得以鉴定，并通过测量标记的肽碎片产生的报告离子的强度来使肽相对定量化从而判断各种蛋白的来源。数据显示，AD脑中报告离子的强度比正常的强，说明异常糖基化水平的上调与AD紧密联系〔7〕。这些数据说明，iTRAQ可以通过定量分析蛋白质的糖基化水平，在AD的早期诊断中发挥其作用。

2.4定量分析线粒体膜蛋白能量代谢是机体维持正常生理功能所必须的，倘若代谢失衡，将导致疾病发生。脑是一高耗能组织，对血流量和氧的需求较高。毫无疑问，AD的发病与能量代谢息息相关。采用iTRAQ技术结合质谱法定量分析3×Tg AD鼠，结果发现24种蛋白表达出现明显失调，其中三分之一属于与氧化磷酸化系统复合体I和IV密切相关的线粒体蛋白〔8〕。另外有数据证明，AD脑内存在着氧化磷酸化系统复合酶Ⅰ和Ⅳ的下调，而线粒体膜蛋白的异常表达引起线粒体能量代谢障碍，从而使神经元变性和坏死，诱发AD〔9〕。

2.5定量分析其他AD相关蛋白采用B104神经母细胞瘤细胞系建立一种体外神经元缺血缺氧模型，利用以iTRAQ为基础的鸟枪法蛋白定量技术分析AD相关蛋白(如ω-谷胱甘肽S-转移酶、14-3-3δ/ζ等)的表达水平，从而对AD做出早期诊断。研究发现，ω-谷胱甘肽S-转移酶这一与AD有关的多功能酶表达水平出现下调，并在抗氧化应激中发挥重要保护作用〔10〕。14-3-3δ/ζ特异蛋白是一种高丰度的衔接蛋白，被称为AD遗传网络的中心枢纽〔11〕。这些研究成果均表明iTRAQ技术在AD的早期诊断中将大有作为。

3展望

iTRAQ 是近年来开发的一种新的蛋白定量技术，它为AD的深入研究提供了一个强有力的平台，也在一定程度上为AD的早期诊断打下了坚实的基础。iTRAQ技术虽然优于其他同位素标记的蛋白定量研究技术，但尚存在一些棘手的问题，如iTRAQ 标记操作时需要胰蛋白酶消化，这就导致结果可能受到样品处理误差或消化程度不同的影响；iTRAQ试剂易受污染；iTRAQ试剂标记蛋白量有限制以及价格昂贵等〔12～14〕。随着质谱技术、软件分析系统的发展，iTRAQ技术有望成为日后定量蛋白质组学研究的核心技术。

4参考文献

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3谢秀枝，王欣，刘丽华，等.iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用〔J〕.中国生物化学与分子生物学报，2011；27(7)：616-21.

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14陈永熙，李娅，张文，等.同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用〔J〕.上海交通大学学报(医学版)，2009;29(5):513-6.

〔2015-03-11修回〕

(编辑李相军)

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通讯作者：罗友根(1970-)，男，博士，副教授，主要从事阿尔茨海默病病因、机制及防治研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.31360238)；江西省自然科学基金资助项目(No.20132BAB205020，20142BAB205030)；井冈山大学2014年度大学生创新创业训练计划资助项目(No.2014029)

〔中图分类号〕Q421

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6616-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.145