复方肾炎片联合强的松对阿霉素肾病幼鼠治疗作用

王英娟，潘凯丽，强 欢，赵晓莉

(1.第四军医大学西京医院儿科，陕西 西安710032；2.榆林市第一医院儿科，陕西 榆林719000；3.西安市儿童医院，陕西 西安710003)

复方肾炎片联合强的松对阿霉素肾病幼鼠治疗作用

王英娟1,2，潘凯丽1，强 欢3，赵晓莉1

(1.第四军医大学西京医院儿科，陕西 西安710032；2.榆林市第一医院儿科，陕西 榆林719000；3.西安市儿童医院，陕西 西安710003)

目的 研究复方肾炎片联合强的松对阿霉素肾病幼鼠的治疗作用。方法 32只4周龄雄性大鼠建立阿霉素肾病模型后，随机分为模型对照组(B组)、复方肾炎片组(C组)、强的松组(D组)和联合用药组(E组)，每组8只，另取8只做为正常对照组(A组)。于造模前1天、造模后2周末、4周末、8周末、12周末共5个时间点检测大鼠24h尿蛋白，12周末检测各组大鼠血白蛋白、血脂及肾功并行肾脏病理检查。结果 ①A组大鼠5个时间点尿蛋白水平无显著变化(F=5.03，P>0.05)；B组、C组、D组、E组大鼠2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白较各自0周末均有显著变化(F值分别为23.59、18.17、14.53、19.61，均P<0.05)。B、C、D、E组8周末及12周末尿蛋白水平均有显著性差异(F8周末=15.66，F12周末=25.43；均P<0.05)，其中B组平均尿蛋白水平最高，8周末为(170.80±38.56)mg/24h，12周末为(141.29±36.55)mg/24h；E组最低，8周末为(37.59±15.36)mg/24h，12周末为(12.40±4.10)mg/24h。②12周末5组间的白蛋白及总胆固醇、甘油三酯较比较，差异有统计学意义(F白蛋白=27.13、F总胆固醇=19.80、F甘油三酯=19.05，均P<0.05)，但其中E组白蛋白、总胆固醇、甘油三酯较A组无统计学差异(均P>0.05)，5组间尿素氮及肌酐水平无统计学差异(F尿素氮=10.75、F肌酐=9.43、均P>0.05)。③E组相较B、C、D组有较轻病理损害，肾间质无增生，肾小管未见蛋白管型。结论 复方肾炎片联合强的松治疗阿霉素肾病大鼠可显著降低尿蛋白及血脂水平，维持血清白蛋白水平，起到有效的治疗作用。

阿霉素；肾病综合征；复方肾炎片；幼鼠

儿童原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome，PNS)是小儿最常见的肾小球疾病之一，临床多首选糖皮质激素(glucocorticoid，GC)治疗，但长期应用可出现代谢紊乱、库欣貌等并发症，且PNS的预后很大程度上取决于患儿对激素治疗敏感性或耐药程度，据报道约有23%PNS患儿为激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS)，且呈逐年上升趋势。因此选择一种可提高激素治疗疗效并减轻激素副作用的药物具有重要意义。复方肾炎片含有丹参、黄芪等中药成分，临床应用对PNS患儿有较好的辅助治疗效果。本研究旨在明确复方肾炎片对阿霉素(adriamycin，ADR)肾病幼鼠血生化及病理学改变，以明确其治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(122.4±16.8)g，由解放军第四军医大学实验动物中心提供，动物生产批号：SCXK-(军)2007-007。

1.2 主要试剂

复方肾炎片(生产批号：Z20025123)；强的松片(生产批号：110207)；考马斯亮蓝溶液(批号：B-1131)；注射用盐酸阿霉素(生产批号：100401)，使用时用生理盐水稀释为2g/L的溶液。

1.3 动物模型的建立及干预方案

40只SD幼鼠简单随机化法选出8只为正常对照组(A组)，剩余32只一次性尾静脉注射阿霉素6.5mg/kg后随机分为4组，即模型对照组(B组)、复方肾炎片组(C组)、强的松组(D组)、联合用药组(E组)，每组各8只。对照组给予等量生理盐水尾静脉注射。

造模后第1周至第12周次日晨灌胃，A组、B组给予蒸馏水灌胃，C组予以复方肾炎片水提取液6.75g/kg灌胃，D组给予强的松混悬液6mg/kg灌胃，E组给予强的松6mg/kg+复方肾炎片6.75g/kg灌胃，灌胃容积为每公斤体重1mL。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 一般情况

每日观察大鼠一般情况，包括饮食，精神状态、体毛、活动情况、二便、水肿变化等，每周称重并记录。

1.4.2 尿蛋白及血清生化

造模前1天及造模后2、4、8、12周末将各组大鼠置于清洁代谢笼中，禁食不禁水留取24h尿液，测量尿液总量后抽取1mL存于EP管中-20℃保存备检。尿蛋白检测方法为考马斯亮蓝法。

12周末，各组大鼠采用3%戊巴比妥钠每公斤体重0.1mL麻醉后剪开胸腹腔，抽取下腔静脉血5mL，3 000r/min离心10min后分离血清-20℃保存备检。大鼠血清白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮检测采用全自动生化分析仪进行检测。

1.4.3 肾组织病理检查

打开大鼠腹腔后从距离肾门约lmm处切取双侧肾脏，用预冷的生理盐水反复灌洗肾脏，待肾脏苍白后，沿纵轴剖开，一半置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后切片，厚度3μm，行HE染色后进行光镜检查。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

阿霉素尾静脉注射后第4天，B、C、D、E组大鼠饮食活动减少，蜷曲、弓背，个别出现腹泻，注射后7～14天，B、C、D、E组大鼠被毛枯黄无光泽、脱毛、消瘦、倦怠少动，出现阴囊及四足的水肿，尤其以后足明显，足尾紫红，舌质紫黯。B组和D组大鼠较C、E组体重下降明显。实验末B、C、D组各死亡3只，E组死亡2只。

2.2 各时间点大鼠尿蛋白定量检测比较

对5组大鼠0周、2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白进行测定。5组大鼠0周末尿蛋白水平无显著性差异(F=7.58，P>0.05)。A组大鼠5个时间点尿蛋白水平无显著变化(F=5.03，P>0.05)；B组、C组、D组、E组大鼠2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白较各自0周末均有显著变化(F值分别为23.59、18.17、14.53、19.61，均P<0.05)。B、C、D、E组8周末及12周末尿蛋白水平均有显著性差异(F8周末=15.66；F12周末=25.43，均P<0.05)，其中B组平均尿蛋白水平最高，8周末为(170.80±38.56)mg/24h，12周末为(141.29±36.55)mg/24h；E组最低，8周末为(37.59±15.36)mg/24h，12周末为(12.40±4.10)mg/24h。见表1。

2.3 12周末大鼠白蛋白及肾功、血脂比较

12周末5组间的白蛋白及总胆固醇、甘油三酯较比较，差异有统计学意义(F白蛋白=27.13；F总胆固醇=19.80；F甘油三酯=19.05，均P<0.05)，但其中E组白蛋白、总胆固醇、甘油三酯较A组无统计学差异(均P>0.05)，5组间尿素氮及肌酐水平无统计学差异(F尿素氮=10.75；F肌酐=9.43，均P>0.05)。见表2。

2.4 各组大鼠肾脏病理学检查

A组大鼠光镜可见肾小球形态正常，肾间质无增生，肾小管未见蛋白管型。B组大鼠肾小球形态正常，基底膜无明显增厚，肾间质增生，结缔组织破坏正常肾小管，有再生肾小管形成，肾小管可见大量蛋白管型及空泡，肾小动脉管壁增厚，部分有空泡形成。C组大鼠肾小球形态正常，肾小球致密斑轻度增生，大动脉管壁变薄，基底膜无明显增厚，肾间质无增生，小动脉管壁增厚，肾小管可见少量蛋白管型。D组肾小球形态正常，基底膜无明显增厚，肾间质无增生，小动脉管壁增厚，肾小管可见少量蛋白管型。E组大鼠光镜可见肾小球形态正常，肾间质无增生，肾小管未见蛋白管型。见附图。

附图 各组大鼠肾脏病理学检查

Fig.Renal pathological examinations of rats in each group

3 讨论

3.1 中西医结合治疗儿童原发性肾病的必要性

儿童原发性肾病综合征具有病程长、反复发作等特点，相较于成人，儿童有较高的发病率，随着病变逐渐进展，大量蛋白从尿中排出，造成血浆白蛋白降低，进而导致脂代谢紊乱。长期单独采用糖皮质激素治疗可带来代谢紊乱、免疫功能低下等副作用。传统医学认为该病久病必伤络，气虚则血瘀，以扶正祛邪，健脾益气，温阳利水，滋养肝肾，活血祛瘀为法[1]。因此，在采用糖皮质激素治疗的基础上结合传统中成药物治疗，有助于改善肾病综合症患儿湿、热、毒、淤的阻滞和脏腑功能虚损导致的肾浊。

3.2 复方肾炎片联合强的松对阿霉素肾病的治疗作用

本研究采用改良的Bertaini法建立阿霉素肾病模型，可在短期内形成微小病变性肾病，可较好的模拟儿童肾病综合征。造模后24小时尿蛋白定量示模型组大鼠2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白显著高于对照组。3个治疗组8周末及12周末尿蛋白水平较模型组有显著下降，而联合用药组12周末较对照组无显著性差异，且较单药治疗有显著性下降。提示复方肾炎片联合激素较单独采用糖皮质激素及复方肾炎片可有效降低蛋白尿水平。同时对血浆白蛋白及血脂水平检测发现，12周末模型组出现白蛋白及总胆固醇、甘油三酯明显代谢紊乱，单一治疗后白蛋白及总胆固醇、甘油三酯较模型组具有显著性改善。而联合用药可显著较单一用药可以显著改善白蛋白及总胆固醇、甘油三酯水平。肾组织病理结果也反映了复方肾炎片与激素联合应用能明显减少阿霉素肾病大鼠肾脏损害。提示复方肾炎片在可防止肾病大鼠出现低蛋白血症，强的松组大鼠体型消瘦明显，可能与长期应用强的松治疗有关。相关研究表明，糖皮质激素可对大鼠的体重增长有明显影响，尤其是肝、脾、肾、子宫等脏器重量显著降低，同时明显降低大鼠骨密度，造成骨质疏松[2]。这可能与糖皮质激素加速组织蛋白分解有关，复方肾炎片补气固表、利尿排毒、健脾益肾的作用可以较好的缓解强的松的副作用。

3.3 复方肾炎片治疗作用的临床机理

复方肾炎片全方由益母草、丹参、蒲黄、茜草、黄芪、黄芩、黄精、茯苓、半枝莲、菟丝子、牵牛子、山楂、芦根、白茅根、车前子等15味传统中药组成，以化瘀、利水、解毒、益肾、健脾组方，活血化瘀药与利尿消肿、清热解毒之品配伍。方中丹参、益母草具有活血化瘀、利尿消肿之功效为君药，黄芪、菟丝子、茯苓、黄精具有补气固表、利尿托毒、健脾益肾、渗湿宁心的功效为臣药，黄芩、蒲黄、半枝莲、菟丝子、牵牛子、山楂、车前子等为佐药，芦根、白茅根为使药，君臣佐使相配而用，针对肾脏病瘀血、热毒、湿热的标实证与气阴两亏的本虚证，起到了补虚泻实、标本兼顾的作用[3]。此方中黄芪性温，味甘，具有益卫固表、补气升阳、益气利水的功效，现代药理研究证实，黄芪可使血液中多核粒细胞增加，增强网状内皮系统吞噬功能，对血浆、肝、脾中环磷酸腺苷(gyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(gyclic guanosine monophosphate，cGMP)的含量与比值起调节作用，促进B细胞增生，使抗体产生增多[4]。有研究发现，黄芪具有调节辅助性T淋巴细胞1( helper T cell 1，Th1)和辅助性T淋巴细胞2(helper T cell 2，Th2)的细胞功能作用[5]。同时黄芪还有类激素作用[6]。益母草有明显的清热解毒、活血利水的作用，可以用于治疗急慢性肾炎时消除蛋白尿，丹参活血化瘀，可以有效地改变肾微循环中的血流，同时具有显著的抗凝、抑制纤维组织增生的作用[7]。白茅根清热生津，凉血止血，利尿、抗菌，有促进凝血酶生成，缓解肾小球血管痉挛，增强机体非特异性免疫的作用[8]。

本实验证实了复方肾炎片联合激素治疗阿霉素肾病大鼠能延缓尿蛋白升高速度，有效降低尿蛋白，减少低蛋白血症、高脂血症的发生，能有效保护肾脏功能，减少肾组织损害，同时可减少激素对大鼠体重降低的副作用。由于本研究对象数量较少，实验时间较短，因此对复方肾炎片长期的治疗作用仍需要进一步观察。该实验研究人员目前正在对复方肾炎片的作用机理进行进一步研究中。

[1]栾健, 王艳,马瑞霞,等.复方肾炎片对STZ诱导糖尿病大鼠作用研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2010, 11(11):1000-1002.

[2]Asagami T,Belanoff J K,Azuma J,etal.Selective Glucocorticoid Receptor (GR-II) Antagonist Reduces Body Weight Gain in Mice[J].J Nutr Metab,2011,2011:235389.

[3]金美芳.复方肾炎片联合贝那普利治疗慢性肾小球肾炎的研究[J].海峡药学,2013,25(1):126-128.

[4]Ma X,Zhang K,Li H,etal.Extracts from Astragalus membranaceus limit myocardial cell death and improve cardiac function in a rat model of myocardial ischemia[J].J Ethnopharmacol,2013,64(6):617-624.

[5]He S, Yang Y, Liu X,etal. Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract inhibits cell proliferation, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblasts by mediating transforming growth factor-beta/Smad pathway[J].Br J Dermatol,2012,166(3):564-574.

[6]Guo L, Bai S P, Zhao L,etal. Astragalus polysaccharide injection integrated with vinorelbine and cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer: Effects on quality of life and survival[J]. Med Oncol,2012,29(3):1656-1662.

[7]Wenden A, Yang Y, Chai L,etal. Salvia Miltiorrhiza Induces VEGF Expression and Regulates Expression of VEGF Receptors in Osteoblastic Cells[J]. Phytother Res,2013，14(4):463-470.

[8]李怀平,黄晨,孙世任,等.复方肾炎片对慢性肾炎患者血浆内皮素水平的影响[J].中国误诊学杂志,2010，10(13):3040-3041.

[专业责任编辑：黄燕萍]

Effects of compound Shenyanpian and Prednisoneon on juvenile rats with Adriamycin-induced nephropathy

WANG Ying-juan1,2，PAN Kai-li1，QIANG Huan3，ZHAO Xiao-li1

(1.DepartmentofPediatrics，XijingHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China; 2.DepartmentofPediatrics，FirstHospitalYulin,ShaanxiYunlin719000,China;3.Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To explore the effect of compound Shenyanpian and Prednisoneon on juvenile rats with Adriamycin-induced nephropathy. Methods After establishing Adriamycin models, 32 4-week-old male rats were randomly divided into model control group (group B), compound Shenyanpian group (group C), Prednisone group (group D) and combination therapy group (group E) with 8 in each group. Another 8 were recruited in normal control group (group A). One day before modeling and at the end of 2, 4, 8 and 12 weeks after modeling 24h urine protein was detected. At the end of 12 weeks serum albumin, lipids and renal function were detected, and renal pathology examination was done. Results In group A the urine protein levels at five time points showed no significant change (F=5.03,P>0.05). Compared with the urine protein levels at 0 week, those at the end of 2,4,8 and 12 weeks were significantly different in group B, C, D and E (Fvalue was 23.59, 18.17, 14.53 and 19.61, respectively, allP<0.05). There were significant differences in urine protein levels at the end of 8 weeks and 12 weeks in group B, C, D and E (F8 week=15.66，F12 week=25.43, bothP<0.05). In group B the mean urine protein level was highest, 170.80±38.56mg/24h at the end of 8 weeks and 141.29±36.55mg/24h at 12 weeks, respectively. However, that was lowest in group E, 37.59±15.36mg/24h at the end of 8 weeks and 12.40±4.10mg/24h at 12 weeks, respectively. At the end of 12 weeks there were significant difference among 5 groups in albumin, total cholesterol and triglycerides (FAlb=27.13,FCho=19.80,FTG=19.05, allP<0.05), but group E was not significantly different from group A (allP>0.05). There was no significant difference among 5 groups in urea nitrogen and creatinine (Furea nitrogen=10.75,Fcreatinine=9.43, bothP>0.05). Compared with group B, C and D, group E had less severe pathological damage. Renal interstitium showed no hyperplasia and no tubular protein casts. Conclusion Compound Shenyanpian and Prednisone can reduce urinary protein and lipid level remarkably and maintain serum albumin level with good therapeutic effect in nephropathy rats.

Adriamycin; nephrotic syndrome; compound Shenyanpian; juvenile rats

2014-08-20

王英娟(1981-)，女，主治医师，在读硕士研究生，主要从事儿童肾脏病及新生儿疾病的治疗工作。

潘凯丽，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.008

R725

A

1673-5293(2015)01-0019-03