胎儿生长受限对物质代谢影响的动物模型研究

郭 翀，陈津津

(上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院儿童保健科，上海200026)

【围产医学研究】

胎儿生长受限对物质代谢影响的动物模型研究

郭 翀，陈津津

(上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院儿童保健科，上海200026)

胎儿生长受限(FGR)在人类中的发病率约为8%，其为导致围产期婴儿发病和新生儿死亡的重要原因之一，且与成年期多种疾病相关。多种动物模型已运用于FGR机制的研究。在FGR动物模型中观察到胃肠道结构和功能的改变，消化液分泌下降，肠道有效吸收率降低。这种变化与胃肠道细胞的基因表达改变有关；同时还可观察到多种代谢关键酶的活性改变。这些结构和功能的改变最终影响FGR动物的消化吸收和物质代谢，并与多种疾病相关。该文主要针对不同种动物FGR的模型研究进行了分析。

胎儿生长受限；动物模型；消化吸收；物质代谢

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是指孕期在母亲子宫内的胎儿生长缓慢，可导致小于胎龄儿(small for gestational age，SGA)的出生，即出生时胎龄在35周及以上，且出生体重低于同胎龄儿童出生体重的第10百分位(P10)。

FGR可分为两大类：对称性FGR(symmetric FGR)和非对称性FGR(asymmetric FGR)，其中非对称性FGR占总数的75%左右。在非对称性FGR中，首先出现体重受限，紧接着是身长、头部则按正常或接近正常的速度持续增长。这可能是在缺氧及营养物质缺乏的情况下优先保证神经系统发育的一种保护性机制。非对称性FGR常由外部因素引起，在孕后期对胎儿发育造成影响。在非对称性FGR中可观察到追赶生长的存在。通过追赶生长，FGR儿童可在一定程度上弥补出生时的体重落后。对称性FGR并不常见，却更令人担忧。对称性FGR通常开始于妊娠早期。由于大多数神经元从孕18周开始发育，对称性FGR的胎儿更可能存在永久的神经系统后遗症。

世界范围内FGR的发病率约为8%，其是导致围产期婴儿发病和死亡的重要原因之一。不良的宫内生长环境与成年期多种疾病相关，包括高血压、心血管疾病、胰岛素抵抗和终末期肾脏疾病。

出于伦理角度考虑，FGR的研究多利用动物模型进行。

1 胎儿生长受限动物模型的建立

多种动物模型已运用于FGR机制的研究，其中多数为啮齿类动物(以大鼠居多)，其他体型稍大的动物模型有绵羊、猪、猴和羔羊。通常模型建立方式是改变孕期饮食营养结构，包括降低碳水化合物、蛋白质及铁的比例[1]。其他模型建立方法包括将孕期动物置于缺氧环境[2]，或利用手术干预，通过降低胎盘血流量以达到宫内缺氧的目的[3-4]。

1.1 鼠的模型

由于动物模型的建立耗时较短，耗费较低，大鼠在FGR的模型建立和相关研究中运用最为广泛[5]。FGR大鼠模型被用于多项代谢相关研究，已证明通过会聚途径诱导胰岛损伤，进而增高2型糖尿病的风险[3]，以及下丘脑-垂体-肾上腺皮质肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenocorticalAxis，HPA)相关的神经内分泌改变[1]。

1.2 羊的模型

由于羊的胎盘血管结构和人类相似度高，胎儿发育过程基本一致，羊动物模型多用于母体和胎儿相互作用的研究。Pardi等(2006年)在母体与胎儿营养物质传输机制的研究中，从羊动物模型观察到的结果证明可预测人体的相应机制，尤其在胎盘供给不足导致的胎儿生长受限(placental insu￣fficiency-induced fetal growth restriction，PI-FGR)中，羊动物模型和人类有很高的相似度，是建立FGR模型的较优选择。

1.3 猪的模型

猪动物模型广泛应用于胃肠移植和胃肠缺血性疾病的临床前期研究[6-9]。在一些代谢性相关疾病，如对2型糖尿病和心血管疾病的研究中，猪的动物模型也提供了重要的研究资料。Quiniou等(2002年)报道，在美国30%的仔猪在出生时被诊断为SGA，在欧洲这一发生率则为6%～10%，在中国尚未见相关报道。相较于啮齿类动物模型，猪动物模型在物质代谢和肠道功能上与人类重合度更高，胚胎期和出生后胃肠道的发育轨迹也更为相似。从猪动物模型所观察到的结果与人类的相应研究结果重合度高。在研究周期和经费允许的情况下，猪的动物模型是研究SGA胃肠道发育的最佳选择[6]。

1.4 灵长类的模型

出于对伦理角度问题的考虑，对灵长类的相关研究大部分被禁止[10]，目前未查及相关研究资料。

2 胎儿生长受限对体内物质吸收的影响

2.1 胃肠道解剖结构的改变

Xu等(1994年)的解剖学研究表明，在猪FGR模型中，肝脏、胰脏及小肠的大小和重量相较对照组成比例降低，提示消化器官细胞总量的减少。病理研究显示，鼠和羊FGR模型中肠绒毛高度和肠隐窝深度减小，黏膜及肌层变薄，肠上皮空泡吞饮消失延迟[11-15]。此类改变在空肠、回肠和结肠中都可见，且贯穿围生期。大鼠的肠道解剖结构的改变提示，FGR的肠道有效吸收面积相较于对照组显著降低。此外，由于分泌腺的细胞数量减少，分泌功能降低，消化液的分泌也相应减少[16]。因此Xu等(1994年)推断，相较于对照组，FGR动物模型的消化和吸收功能显著降低。此外，与对照组相比，鼠的FGR模型显示断奶前黏蛋白2和肠三叶因子(trefoil factor family 3，TFF3)水平在结肠黏膜中表达下降；断奶后，黏蛋白2和黏蛋白4的mRNA水平在结肠黏膜中下降；而黏蛋白和TFF3在肠上皮细胞的保护和修复中发挥重要作用，提示FGR影响肠屏障成熟，可增加结肠感染的风险[17]。同时，在SGA动物模型中观察到顶端小管系统(apicalcanalicular system，ACS)的表达和大型吞饮泡的产生。利用大吞饮泡进行大分子的胞内吸收是胎儿期肠上皮细胞的特点，FGR动物模型通过这种“胎儿期模式”(Fetal-type)弥补FGR带来的消化吸收功能下降。这种“胎儿期模式”通过非选择胞饮吸收肠腔内大分子，再利用染色体酶进行消化。Skrzypek(2007年)研究认为，在未患FGR的动物模型中，这种特殊吸收模式在生后21天消失，而在FGR模型中，此模式可延长至生后28天。这种特殊模式在一定程度上弥补了消化吸收功能的下降，同时也带来了一定的致病风险。无选择的胞饮意味着肠道暴露于致病菌，这可能增加感染性腹泻、坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)和过敏性胃肠病的易感性。FGR是NEC的危险因素之一。Nilsen等(2005年)的流行病学研究亦提示FGR可能预示着成年期结肠癌。同时，肠道黏膜延迟成熟也会导致FGR儿童更难适应食物改变[16]。不成熟的肠道屏障亦可能增加成年时罹患肠道疾病的可能性[18]，甚至非致病菌都可能引发轻度的免疫反应，进而导致肠道炎症。为弥补这类改变，在猪的FGR模型中可观察到肠道屏障相关基因的表达改变，包括黏蛋白合成增加及抗炎反应[11]。

2.2 胃肠道细胞编程的改变

多种动物模型显示FGR小肠上皮细胞的分裂和凋亡活动有改变。大鼠的FGR模型显示，其小肠重量和肠细胞数量均减小。这些变化与肠细胞中凋亡基因的表达相关。在FGR大鼠的肠末端观察到抗凋亡基因Bcl-2的mRNA减低，凋亡基因Bax和p53的mRNA表达增高。这一发现已被Baserga等(1989年)证实。在Avila等(1989年)的研究中观察到Bax蛋白水平和caspase-3活性的增高。D’Inca等[11]运用RT-PCR技术，发现编码凋亡蛋白(如PTPN12和FBXL10)的mRNA表达上升，与之相对，编码抗凋亡蛋白(如BOK)的mRNA表达下降。其利用末端转移酶介导的缺口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)检测，证实了猪FGR模型中肠道细胞凋亡率的上升。同样，BAX的表达在猪FGR模型出生后第5天显示了上升趋势。同时，增殖细胞核抗原(PCNA)的表达在猪FGR模型出生时显著下降，在生后第2天PCNA表达下降的趋势仍可在猪FGR模型中观察到[15]。Wang等(2008年)利用2-dimensional-PAGE MS技术分析蛋白质组学，结果显示FGR的免疫相关蛋白，如免疫球蛋白和膜联蛋白A1含量减低；抗氧化物质，如转铁蛋白，PRX1蛋白(Peroxiredoxin 1)和ζ-crystallin减低；蛋白质水解蛋白，如Proteasomeα-5和α-1 subunits增高。这些提示细胞信号通路、氧化还原平衡被动打破，可能蛋白水解的增加是各器官减小的原因。

2.3 肠道菌群的改变

目前关于FGR菌群构成的相关资料仍较为匮乏。在猪的FGR模型中分析回肠和结肠肠黏膜菌群构成，结果显示相较于对照组，FGR的粘附性菌群增多[11]。在一项以大鼠作为模型的研究中，对照组在生后12天出现了急速的菌群建立，该现象在FGR组则提早1周出现，并且相较于对照组，FGR的双歧杆菌属相对减少，大肠杆菌属相对增加。在菌群数量上二者亦有显著性差异。需氧菌相较于厌氧菌数量减少，革兰阳性菌相较于革兰阴性菌减少。菌群构成的改变可影响丁酸的产生，进而影响长期的健康状况[19]。诸多因素与菌群改变相关。首先，由于菌群构成、生长和粘附都与肠道肌电活动有关，肠道运动功能减弱会影响菌群定植的结果；其次，FGR的炎性细胞因子白介素(IL)-6的表达改变可能亦是原因之一[20]；再者，肠道屏障的改变也可能导致菌群种类和数量的变化。

3 胎儿生长受限对体内物质代谢的影响

3.1 碳水化合物代谢

在猪的FGR模型中观察到碳水化合物代谢的关键酶活性减低。绒毛刷状缘的酶，如乳糖酶、麦芽糖酶和蔗糖酶的活性均下降[16]。Lebenthal(1981年)的研究显示，在小鼠模型7～9个月孕期中母亲-胎儿血流的减少会导致绒毛刷状缘的部分酶类选择性减少，如乳糖分解酵素和碱性磷酸酶，但其他酶类，如麦芽糖酶和肠激酶尚未发现受到影响。亦有研究显示糖酵解的主要参与酶，如烯醇酶、果糖二磷酸醛缩酶和磷酸丙糖异构酶在FGR模型中下降[21]。Buchmiller-Crair等(2001年)研究显示，在兔的FGR模型中，乳糖分解酵素和麦芽糖酶的活性都较对照组下降。这种二糖酶的表达模式贯穿整个新生儿期，直至追赶生长2周后酶的水平才恢复正常。

3.2 脂类代谢

在猪的FGR模型中，LIU等[22]观察到肝脏脂蛋白脂肪酶活性在孕期110天时下降。该酶活性的降低可能增高FGR患高甘油三酯血症的风险。Boehm等(1991年)的研究显示，在出生体重低于400g的猪FGR模型中，十二指肠液中脂肪酶的活性显著下降。尽管并未影响到脂类吸收的关键因素(如胆盐)，这种活性的变化可能对脂类的吸收带来不利影响。利用2-D电泳，WANG等[21]发现，在生后第1天、第7天和第21天，载脂蛋白A-Ⅰ和载脂蛋白A-Ⅳ在猪FGR模型的空肠黏膜中降低，该类载脂蛋白在脂类转运中起到关键作用。同时，脂肪酸结合蛋白1和5(FABP1和FABP5)同样在猪FGR模型出生后第1天和第21天降低，但在出生后第7天降低不明显。这类蛋白在脂肪酸的吸收、转运和代谢中起到重要作用。胆固醇通过Cyp7a1转化为胆酸[23]。FGR作为一个影响因素可增加高脂饮食小鼠的胆固醇和胆酸量，同时减低Cyp7a1蛋白量，说明FGR可增加高脂饮食小鼠高胆固醇血症的风险[24]。

3.3 氨基酸代谢

Boehm等(1991年)的研究认为，FGR患儿小肠中的胰蛋白酶水平在正常儿童的波动范围内，然而，此项研究存在一定缺陷。实验中胰液取样时间是随机的，并没有按照胰腺分泌的规律。在猪FGR模型的空肠代谢研究中，相较于对照组，FGR的氨基酸水平，包括缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸苯丙氨酸和酪氨酸显著下降，但精氨酸、蛋氨酸和色氨酸的水平并未受到影响[25]。此外，WANG等[21]的研究显示上述氨基酸合成转变的关键酶在猪的FGR模型中出现改变，其对猪FGR模型肠道的蛋白质组学分析表明，相较于对照组，FGR的线粒体鸟氨酸氨基转移酶在其出生后第1天、第7天和第21天持续降低，而这种酶是精氨酸和鸟氨酸转化为γ-氨基丁酸和谷氨酸这类重要神经递质的关键酶。

3.4 维生素和矿物质代谢

Mollard等(2004年)利用双能X线吸收测量骨量，观察到猪FGR模型加大钙在近端小肠的吸收量以支持在生后第1周的追赶生长。该现象在生后21天仍可见。尽管如此，相较于对照组，FGR的骨量仍偏低。FGR模型的蛋白质组学分析显示，在生后第1天至第21天，猪FGR模型中铁代谢相关蛋白，包括转铁蛋白、血红素结合蛋白和结合珠蛋白的浓度减低。这可在一定程度上解释FGR的铁代谢效率低下。同时，铁吸收的下降可能与小肠炎性反应相关，进而导致铁调素(一种肝脏中的25个氨基酸的肽类激素)表达上升，抑制肠道的铁吸收。视黄醇结合蛋白2(RBP2)是肠上皮中唯一的视黄醇(维生素A)的转运蛋白，其在FGR中的表达水平下降[21]。RBP2的缺乏可影响诸多维生素A相关通路，进而导致生长受限和相关免疫反应，亦可影响铁代谢。同时，由于维生素A影响脂肪细胞分化、脂解、脂肪酸的氧化以及葡萄糖的转运，上述改变可能增加成年期罹患代谢相关疾病的风险[26-27]。

4 结论

以上研究显示，与正常对照比较，FGR动物模型在消化吸收和代谢上有诸多差异。这些差异会影响其出生后的生长发育，也可能与成年期相关代谢性疾病，如肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等相关。出于伦理道德的考虑，相关实验难以在人体进行，因此动物模型在研究人类FGR中起到重要的作用。在研究周期和经费允许的情况下，猪的动物模型是研究FGR的最佳选择。

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[专业责任编辑：杨文方]

Impact of fetal growth restriction on metabolism in animal models

GUO Chong, CHEN Jin-jin

(DepartmentofChildHealthCare,Children’sHospitalofShanghai,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200026,China)

Around the world almost 8% of human pregnancies are diagnosed as fetal growth restriction (FGR). FGR is one of the important causes of perinatal morbidity and mortality, and is also associated with metabolic diseases in adulthood. A variety of animal models have been used in the research of FGR. Studies on animal models have shown changes in gut structure and function in FGR individuals, which lead to decline of the secretion of digestive juice and low rate of intestinal absorption. These changes are correlated with the change of gene expression. Moreover, activities of main enzymes are decreased in FGR individuals. These changes in structure and function ultimately affect the digestion, absorption and the metabolism of FGR animals, and they are also related with some diseases. In this paper, different kinds of FGR animal models were analyzed.

fetal growth restriction (FGR)；animal model；digestion and absorption；metabolism

2014-10-14

国家自然科学基金资助项目(30801205)；上海市科委自然科学基金资助项目(12ZR1425600)；上海市科委医学引导类项目(14411965200，14411970900)；上海市科委重大资助项目(12411952401)

郭 翀(1990-)，女，上海交通大学医学院儿科学在读硕士研究生，主要从事儿童生长发育的研究。

陈津津，副教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.064

R714.5

A

1673-5293(2015)01-0161-04