靶向微泡携带药物联合低频超声溶栓的研究进展

阿丽米娜·阿文 穆玉明

新疆医科大学第一附属医院心脏超声诊断科，新疆乌鲁木齐 830011

通过超声溶栓可以追溯到1976 年，Trubestein等[1]证明了第一个通过体外低频率超声波能量可破坏血凝块，促使其溶解。此项调查还显示，这个系统有溶解外周动脉血凝块的潜力并广泛用于动物体内溶栓实验。 后来，出现了4 个通过超声溶栓的基本方法：①通过导管外部传感器超声溶栓；②经皮超声不添加药物或微泡和超声结合溶栓药物和/或结合微泡共同溶栓；③通过导管结合超声与靶向微泡；④经皮低频超声与全身系统性（静脉）药结合增加超声波溶栓的疗效。

1 血栓溶栓治疗的现状

目前利用超声联合靶向微泡造影剂共同溶栓已被证实是一种快速溶解血栓的方法，其对预防急性冠状动脉和脑动脉血栓形成均起了重要作用。

Nederhoed 等[2]通过制作猪急性周围动脉闭塞的模型验证了超声联合微泡溶解血栓是目前较好的溶栓方式。 微泡造影剂，尤其是联合超声的微泡造影剂在急性外周动脉闭塞疾病的治疗中，具有很好的溶栓前景[3-4]。 通过超声联合微泡造影剂共同作用，可进一步增强远端小血管的溶栓效果[5-7]。 在超声强度方面，体外低频超声，主要是通过加速纤溶酶对凝血块的纤溶作用从而达到溶栓，此时再将粒径为1～10 μm的微泡震荡后联合超声溶栓，那么尽管在更高强度的超声条件下也同样能达到血栓及血凝块的快速溶解[8]。因此1～10 μm 粒径大小的微泡在治疗下肢血栓的疾病中具有较好的溶栓效果。研究表明使用微泡增强溶栓时，选择超声频率，主要考虑以下3 个因素：微泡的大小，这会影响其谐振频率[8-9]；衰减频率的增加，更高的频率下限制了治疗的深度；增加较低的频率时就可以形成定波的机会[10-11]。 亦有研究证实微泡空化作用的阈值会随频率的增加而提高[12-15]。 因此合理的超声频率、微泡的粒径大小以及溶栓的时间长短都是溶栓的关键因素，通过调整其中的条件，可使超声联合微泡起到共同作用从而提高血栓的快速和彻底溶解、达到预防血栓形成的目的。 Alexandrov 等[16]通过靶向超声联合微泡对猪的下肢血管栓塞模型进行治疗[17]，显示猪和人的凝血和纤溶系统有着类似的组成成分[18]，即当服用抗血小板药物并联合超声微泡两种不同的溶栓方法时， 对末端血管的溶栓效果结果显示更好，能够达到血栓的完全溶解。

2 超声频率的选择

选择超声频率，主要因素为：微泡的大小，这会影响其谐振频率；衰减频率的增加，更高的频率下限制了治疗的深度；增加较低的频率时就可以形成定波的机会；除此还有微泡空化作用的阈值会随频率的增加而提高。过去的研究中有的采用“低”频率（20～500 kHz），有的采用“高”频率（MHz）的范围[19]。 迄今为止大多数临床和体内研究中使用过的较高的超声频率，最常见范围是TCD 设备中常规的1～2 MHz。 使用频率较低的超声具有通过体积较大的声波作用来改进的颅骨穿透力与定位的优点。然而一定要慎重选择照射参数以确保其安全，一个有名的临床试验中使用了300 kHz的超声（无微泡），因高发的颅内出血情况被迫提前终止[21]。 后续的工作建议涉及血-脑屏障的破坏，这可能是由于使用超长、超宽主脉冲[20]造成多反射干扰或高于空化阈值的压力形成定波，这两者都可以通过改变照射的参数进行补救[22]。

3 与溶栓有关的指标

尽管经皮冠状动脉介入治疗或药物溶栓，远端微栓塞的现象仍有发生。使用超声微泡溶栓治疗是诱导微气泡振荡导致血块破坏和恢复灌注的方法。微血管阻塞是一个复杂的多因素现象，包括微循环痉挛，血小板聚集和微血管血栓。

3.1 微血栓的形成

微血栓发生于微循环血管内， 是一种透明血栓，由嗜酸性同质性的纤维蛋白构成， 是纤维素性血栓。血栓颗粒尺寸范围从10 ～200 μm， 平均直径为（17.3±3）μm。

3.2 影响溶栓的相关因素

3.2.1 组织因子（tissue factor，TF） TF 由凝血蛋白酶级联细胞引发，参与止血，在血栓的形成过程中具有重要作用，在炎症和细胞免疫反应，组织中TF 的细胞分布尚未被描述。 TF 是在组织中选择性表达，与细胞而不是细胞外基质相关。在血管内皮细胞和外周血细胞中可检测。 TF 作为凝血途径的起始因子[23-24]，也被名为血小板组织因子、 因子Ⅲ、 凝血活酶或cd142，它是一种蛋白，在内皮组织和白细胞中存在，是启动凝血酶形成凝血酶原的必要因子，TF 作为外膜细胞，在细胞核平滑肌细胞参与了凝血途径[25]。Golinp 等[26]研究发现，TFPI21 在动脉粥样硬化病变时表达会代偿性增高。 Kong 等[27]研究证实，在离体实验中TFPI22 能抑制MMP22 活性。

3.2.2 P/T 比值 即血浆6-酮-前列腺素Flα（6-ketoprostaglandin1-α，6-keto-PGF1α） 与血栓素B2（thromboxane B-2，TXB-2）的比值。 P/T 比值升高易导致血小板聚集、血栓形成，促使动脉粥样硬化和冠心病。出血、 损伤和内毒素休克动物血浆中TXB2 显著增加，这与休克时肺循环阻力升高有关。 李小鹰等[28]的研究表明：在正常生理情况下6-leto- PGF1a 和TXB2 保持着一定的比例关系，P/T 比值变化可反映血管舒缩状态和血小板聚集能力，二者平衡在维持正常组织灌注和血流通畅方面起重要作用一旦失衡就可能导致血小板黏附、聚集，微血管痉挛，微血栓形成、组织灌注不良等一系列病理改变。

3.2.3 P-选择素（P-selectin） P-selectin 是常用的血小板活化指标，其水平高低反映了血小板的活化程度，且敏感性、特异性均较高，化学性质稳定，测定程序已标准化。有研究表明静息血小板的α 颗粒膜上有少量P-选择素表达。 Merten 等[29]的研究发现：GPⅡb/Ⅲa 受体复合物逐渐陷入或移入血小板小管系统，P-选择素作为唯一的连接分子血小板表面仅留下大量的存在，它通过与相邻血小板表面的硫脂类受体相结合， 使血小板连接形成大而稳定的血小板血栓，因此P-选择素可作为检测早期动脉血栓的靶标， 在动脉血栓形成过程中发挥了重要作用。

3.2.4 炎症因子与血栓的关系 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 被认为是导致全身炎症反应综合征一个最主要的炎性介质。 对于TNF-α 在急性缺血再灌注过程中的表达和作用的研究结果表明，肢体急性缺血再灌注后，TNF-α 的表达显著增高，也与不少研究提示的脑缺血再灌注损伤后，TNF-α 达迅速增加一致[30]。 炎性反应介导了肢体再灌注损伤，而中性粒细胞的聚集和浸润及白细胞介素l（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）等大量炎症因子的释放是炎性反应发生、发展的关键。

3.2.5 血管性假血友病因子（von Willbrand factor，vWF） vWF 是一种多聚体糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、储存（Weibel-Palade 小体）和释放，亦有少量由血小板储存（α 颗粒）和释放。 它既可与小板膜糖蛋白 在血栓形成过程中发挥着重要作用， 它既可与小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa 结合，又可以和胶原介导血小板结合， 又可以和胶原介导血小板、黏附、聚集于受损的血管内皮下组织，导致聚集于受损的血管内皮下组织，导致栓形成，因此它可以作为血管内皮受损的标志物。

3.2.6 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） VEGF 属于血小板源生长因子超家族重要成员，可由血管内皮细胞等多种细胞分泌， 具有生理和病理性血管增生和通透性调节作用。 Waltham 等[31]发现VEGF 和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在大鼠的下腔静脉自然溶解血栓中表达，在血栓的再通和机化中起了调节作用，并且VEGF 和bFGF 在下腔静脉壁未见有表达， 血清中VEGF 和bFGF 水平变化不明显。 静脉注射VEGF 治疗静脉血栓研究表明，VEGF 可促进管腔再通、血栓机化。

3.3 溶栓后的病理改变

研究表明，血栓溶解后，大栓子脱落造成下游微血管（30～150 μm）栓塞，用Masson 病理染色观察其结果为动脉微栓塞内，可见团块状、均质、绿染的纤维蛋白结构，其周边散在红色颗粒状沉积的红细胞。 徐亚丽等[32]通过制作股动脉血栓，在不同条件下溶栓后，对末梢微循环内微血栓进行检测：采集末梢血管标本，用中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，将组织切成4 μm 厚的切片。 进行HE 染色以观察微血栓的形成。 微血栓指在小于150 μm 的微血管中，由血小板、纤维素和/或红细胞组成，HE 染色呈粉红色，单纯的红细胞堆积认为是血管中残留的血液，HE 染色呈点样深红色。同时取两张切片进行马休黄-酸性品红-苯胺蓝（改良Lendrum 法）染色，观察冠脉微血管栓塞组成成分，纤维素呈鲜红色，肌纤维呈红色，细胞核呈蓝褐色，胶原纤维呈蓝色，红细胞呈黄色，陈旧的纤维素成紫蓝色。

4 传统的药物溶栓与靶向微泡、尿激酶联合超声溶栓的现状比较

近年来超声微泡造影剂制备被不断研发更新中，不同的血栓助溶研究多采用不同的超声微泡，其血栓助溶效果也存在差异。 在体内，微泡的性能是受其材料结构、微泡粒径和血液中的稳定性影响的，也依次由许多参数，包含在微泡内的气体、外壳材质和分布决定。 其中，微泡膜和内核气体与微泡粒径及稳定性密切相关，是影响血栓助溶作用的主要因素。

微泡的靶向性能够增大血块附近微泡的浓度，从而增大它的溶栓作用，与此同时增加微泡在血块附近停留的时间。这样可能能够降低超声的强度和微泡的剂量，以减少发生副作用的风险，并增加其安全性。采用微泡注射，在体外和体内的相关研究表明，微泡通过携带或不携带溶栓药，可协助血栓溶解，而且对周围的微血管再灌注有作用。在短时间内可提供增强了的造影；经实验证明，连续给药可以延长超声造影增强的有效期，同时还可增强造影，已被应用于一些超声溶栓的临床试验中。微泡增强超声溶栓的另一个问题是如何使药物和微泡运输到血流减少的区域。Culp等[33]关于低频超声下犬动静脉移植物的研究已经强调了微泡运输到血凝块的困难性，其中直接移植内注射微泡往往比静脉注射取得更多的再通。 Xie 等[34]研究了“引导图像”超声治疗法，血凝块在诊断性超声中连续成像，并且只有当微泡在缺血区域中被检测到时才能触发高强度的治疗性脉冲。通过超声联合微泡溶栓可能会使血栓破碎成小块，但如果碎片大于下游毛细血管的直径，这就会增加二次栓塞的风险。血凝块碎片的大小在很大程度上取决于超声照射强度[35]。 有研究观察到在不使用微泡或纤溶药物的情况下，在体外用20 kHz 脉冲模式超声处理人类血栓时，99%的血凝块碎片都小于10 μm[34]。

4 结论与展望

综上所述，微泡结合超声溶栓是一个全新的研究领域，影响因素也较多，因此将携带溶栓药物尿激酶的靶向微泡造影剂经静脉注射后，如能充分考虑到超声的发射频率、强度、时间，溶栓药物的剂量等因素，不仅可以达到对靶向血管内血栓的完全溶解，同时也能达到预防微循环的再栓塞。超声联合微泡溶栓的治疗过程中，对相关参数最优化，治疗方案进一步优化及靶向微泡的合理应用，会进一步提高临床溶栓治疗的安全性和有效性。 因此，超声联合靶向微泡溶解血栓有望能快速提高目前溶栓治疗的安全性和溶栓效率。

[1] Trübestein G，Trübestein R，Ludwig M，et al. Fibrinolytic therapy of deep venous thrombosis[J].Vasa Supplementum，1991，32（5）：806-806.

[2] Nederhoed JH，Slikkerveer J，Meyer KW，et al. Contrastenhanced sonothrombolysis in a porcine model of acute peripheral arterial thrombosis and prevention of anaphylactic shock [J]. Lab Animal，2014，43（3）：91-94.

[3] Xing R，Liu G，Zhu J，et al. Functional magnetic nanoparticles for non-viral gene delivery and MR imaging [J].Pharmaceutical Research，2014，31（6）：1377-1389.

[4] Maxwell AD，Cain CA，Duryea AP，et al.Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy [J].Ultrasound in Medicine&Biology，2009，35（12）：1982-1994.

[5] Hagisawa K，Nishioka T，Suzuki R，et al. Enhancement of ultrasonic thrombus imaging using novel liposomal bubbles targeting activated platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa complex——in vitro and in vivo study [J]. International Journal of Cardiology，2011，152（2）：202-206.

[6] Hu G，Liu C，Liao Y，et al. Ultrasound molecular imaging of arterial thrombi with novel microbubbles modified by cyclic RGD in vitro and in vivo[J].Thromb Haemost，2012，107（1）：172-183.

[7] Anderson CR，Hu X，ZhangH，et al. Ultrasound molecular imaging of tumor angiogenesis with an integrin targeted microbubble contrast agent [J]. Investigative Radiology，2011，46（4）：215-224.

[8] Hitchcock KE，Holland CK. Ultrasound-assisted thrombolysis for stroke therapy： better thrombus break-up with bubbles [J]. Stroke，2010，41（10）：S50-S53.

[9] Nedelmann M，Ritschel N，Doenges S，et al. Combined contrast-enhanced ultrasound and rt-PA treatment is safe and improves impaired microcirculation after reperfusion of middle cerebral artery occlusion [J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism，2010，30（10）：1712-1720.

[10] Baron C，Aubry JF，Tanter M，et al. Simulation of intracranial acoustic fields in clinical trials of sonothrombolysis [J]. Ultrasound in Medicine & Biology，2009，35（7）：1148-1158.

[11] Ammi A Y，Mast D T，Huang I，et al. Characterization of ultrasound propagation through ex-vivo human temporal bone [J]. Ultrasound in Medicine & Biology，2008，123（5）：3632-3632.

[12] Shen ZY，Shen E，Zhang JZ，et al. Effects of low-frequency ultrasound and microbubbles on angiogenesis-associated proteins in subcutaneous tumors of nude mice [J].Oncology Reports，2013，30（2）：842-850.

[13] Terahara T，Mitragotri S，Kost J，et al.Dependence of lowfrequency sonophoresis on ultrasound parameters； distance of the horn and intensity [J]. International Journal of Pharmaceutics，2002，235（1）：35-42.

[14] Alexandrov A. Ultrasound-enhanced systemic thrombolysis for acute ischemic stroke [J]. New England Journal of Medicine，2006，351（21）：23.

[15] Viguier A，Petit R，Rigal M，et al. Continuous monitoring of middle cerebral artery recanalization with transcranial color-coded sonography and levovist [J]. Journal of Thrombosis & Thrombolysis，2005，19（1）：55-59.

[16] Alexandrov A. Ultrasound-enhanced systemic thrombolysis for acute ischemic stroke [J]. New England Journal of Medicine，2006，351（21）：23.

[17] Kesava P，Graves V，Salamat S，et al. Intraarterial thrombolysis in a pig model： a preliminary note [J]. Ajnr American Journal of Neuroradiology，1997，18（5）：915-920.

[18] Nally JE. The applications of proteomics to animal models of leptospirosis：in vivo veritas [J]. Farm Animal Proteomics，2012：50-52.

[19] Molina CA，Ribo M，Rubiera M，et al. Microbubble administration accelerates clot lysis during continuous 2-MHz ultrasound monitoring in stroke patients treated with intravenous tissue plasminogen activator [J]. Stroke，2006，37（2）：425-429.

[20] Alexandrov AV，Mikulik R，Ribo M，et al. A pilot randomized clinical safety study of sonothrombolysis augmentation with ultrasound activated perflutren lipid microspheres for acute ischemic stroke [J]. Stroke，2008，39（5）：1464-1469.

[21] Tsivgoulis G，Eggers J，Ribo M，et al. Safety and efficacy of ultrasound-enhanced thrombolysis： a comprehensive review and meta-analysis of randomized and nonrandomized studies [J]. Stroke，2010，41（2）：280-287.

[22] Stride E. Physical principles of microbubbles for ultrasound imaging and therapy [J]. Frontiers of Neurology &Neuroscience，2015，36（Suppl 2）：11-22.

[23] Edgington TS，Mackman N，Brand K，et al. The structural biology of expression and function of tissue factor [J].Thrombosis & Haemostasis，1991，66（1）：67-79.

[24] Bach RR. Initiation of coagulation by tissue factor [J].Crc Crit Rev Biochem，1988，23（4）：339-368.

[25] Slavik L，Prochazka M，Prochazkova J，et al. The role of tissue factor in activation coagulation system at pregnancy complications[J].Thrombosis Research，2015，133（14）：S109.

[26] Golino P，Ravera A，Ragni M，et al. Involvement of tissue factor pathway inhibitor in the coronary circulation of patients with acute coronary syndromes [J]. Circulation，2003，108（23）：2864-2869.

[27] Kong D，Ma D，Bai H，et al. Expression and characterization of the first kunitz domain of human tissue factor pathway inhibitor-2 [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications，2004，324（4）：1179-1185.

[28] 向凝，李小鹰，李金生，等.腺苷对兔溶栓后微循环障碍影响的实验研究[J].中国康复医学杂志，2005，20（9）：656-659.

[29] Merten M，Chow T，Hellums JD，et al. A new role for Pselectin in shear-induced platelet aggregation [J]. Circulation，2000，102（17）：2045-2050.

[30] Ho Y，Xiong Y，Ho D S，et al. Targeted disruption of the glutaredoxin 1 gene does not sensitize adult mice to tissue injury induced by ischemia/reperfusion and hyperoxia [J]. Free Radic Biol Med，2007，43（9）：1299-1312.

[31] Waltham M，Burnand KG，Collins M，et al. Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor are found in resolving venous thrombi [J]. Journal of Vascular Surgery，2000，32（5）：988-995.

[32] 徐亚丽，高云华，高政，等.微泡增强超声助溶兔股动脉血栓的实验研究[J].中国超声医学杂志，2006，22（6）：404-406.

[33] Culp W C，Porter T R，Feng X，et al. Microbubble potentiated ultrasound as a method of declotting thrombosed dialysis grafts：experimental study in dogs [J]. Cardiovasc Intervent Radiol，2001，24（6）：407-412.

[34] Xie F，Lof J，Everbach C，et al. Treatment of acute intravascular thrombi with diagnostic ultrasound and intravenous microbubbles [J].Jacc Cardiovasc Imaging，2009，2（4）：511-518.

[35] Wright C，Hynynen K，Goertz D. In vitro and in vivo high-intensity focused ultrasound thrombolysis [J]. Investigative Radiology，2012，47（4）：217-225.