脊柱结核基因诊断进展

脊柱结核基因诊断进展

钟志伟，黄艳，彭艳，武汉*

(吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033)

随着HIV肆虐及免疫缺陷病患者的增加，全球结核发病有明显上升趋势，中国是全球22个结核病高负担国家之一[1]， 结核患者数居世界第2位，脊柱结核作为常见的继发性肺外结核发病率也明显增加。目前脊柱结核的诊断主要是根据临床表现、影像特征、实验室检查及诊断性治疗情况进行综合诊断[2]，现行的实验室诊断和耐药性检测及菌种鉴定方法远不能满足脊柱结核早期诊治的需求，迫切需要加强新技术的研究和应用。近年来，基因诊断作为疾病诊断的研究热点正逐步应用于临床，其对疾病诊断价值已得到广泛认同，本文将主要从常用脊柱结核基因诊断技术、基因诊断的优缺点及相关研究进展方面作一综述。

基因诊断又称DNA诊断，它是利用重组DNA技术，直接从基因水平检测致病微生物的存在和种类，从而对临床疾病作出诊断。1972年Goff SP和Berg P首次成功重组了世界上第一批DNA分子，标志着基因检测技术的诞生[3]。20世纪70年代中后期，由于PCR、基因芯片等技术的出现基因检测得到了快速发展[4]。从病原学角度，基因诊断可应用于各种病毒、细菌和寄生虫病的检测，随着结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成，结核疾病的诊断也进入了基因时代，基因诊断技术在脊柱结核诊断领域的应用已越来越被人们所认识，它在病原体检测、药物选择和疗效评价等方面具有重要作用，必将为脊柱结核的防控和诊治作出重大贡献。

1常用脊柱结核基因诊断技术

脊柱结核是结核分枝杆菌全身感染的局部表现，约占骨关节结核50%，好发于儿童和青少年[5]。以腰椎最为多见，胸椎次之，胸腰段占第三位，颈椎和骶椎较少见。其中，椎体结核约占99%、椎弓结核占1%左右。受累的脊柱表现有骨质破坏及坏死，有干酪样改变和脓肿形成，椎体因病变和承重而发生塌陷，严重者可造成瘫痪[6]。由于脊柱结核患者早期典型临床特征不明显，很容易造成误诊或者漏诊，目前脊柱结核诊断仍以临床症状结合X线、CT、MRI表现为主要诊断手段，尚缺乏敏感度高、特异性强的早期诊断指标[7]。应用基因诊断技术对脊柱结核的早期发现、脊柱结核患者的耐药监测、疗效判断等都具有较大的临床使用价值和意义。目前常用的脊柱结核基因检测技术主要有聚合酶链反应( polymerase chain reaction， PCR)、基因芯片、核酸杂交等。

1.1　聚合酶链反应( polymerase chain reaction，PCR)技术

聚合酶链反应技术是指在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，即体外DNA扩增技术，包括变性、退火及延伸等几步反应，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断[8]。Hance等[9]最先把PCR技术应用到结核杆菌的诊断，扩增出一383bp序列，编码65kD分枝杆菌抗原，再用探针杂交，敏感度达到样品细菌数少于100个即可被检出的水平。对于骨关节结核基因诊断的报道始于1994年Lombard EH等[10]利用基因诊断技术检测24名疑似骨结核病患者的骨髓液，其阳性率达到42%，明显高于涂片抗酸染色法。随后Sun Y等[11]也应用PCR技术检测60名骨结核病人骨髓液，阳性率为83%，发现基因检测技术对诊断骨关节结核具有重要应用价值。作为简单有效的诊断方法，PCR技术在脊柱结核的诊断中已发挥了显著作用。Li等[12]采用荧光定量PCR技术及抗酸染色法对208例结核病患者痰液中结核分枝杆菌进行检测，结果显示两种方法检出阳性率分别为51.92%和25.96%， PCR法检出的阳性率明显高于抗酸染色法检出的阳性率。同样Portillo-Gomez等[13]运用不同方法检测286例肺外结核病人脑脊液、胸膜液及腹水中结核分枝杆菌，发现PCR技术的特异性、敏感性最高。Bahram等[14]发现，通过多重实时定量PCR对不同管家基因的测定，可以快速准确地鉴别结核分枝杆菌属和非结核分枝杆菌属，对临床脊柱结核疾病诊断具有重要作用。此外，研究表明，MCP-1-2518 位点GG 基因型和G 等位基因均可能与脊柱结核的易感性相关，通过PCR技术检测人群基因组DNA中MCP-1-2518 位点的G、A 等位基因的分布频率[15]，可以预测患者罹患脊柱结核的风险，从而对易感人群进行预防性保护。

1.2　基因芯片

随着分子生物学技术的不断发展，基因诊断在脊柱结核诊断中作用日益明显，而基因芯片技术的发展成为脊柱结核耐药基因诊断的一个新里程碑，基因芯片是通过微阵列技术将大量的DNA片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息[16]，是伴随“人类基因组计划”的研究进展而快速发展起来的一门高新技术。Zhang等[17]最先将基因芯片用于脊柱结核诊断，研究表明在对153名脊柱结核患者利福平及异烟肼耐药检测中，CapitalBio? 基因芯片灵敏度达到93.55%?，检测过程平均用时仅5.8小时，具有高通量检测、灵敏准确、高效快速等优点。随着结核病疫情不断恶化，脊柱结核发病率及复发率亦逐年增加，耐药结核、耐多药结核甚至广泛耐药结核的流行是主要原因之一[18]。通过基因芯片技术诊断耐药脊柱结核，可有效控制患者复发率。近年生物技术不断发展，结核分枝杆菌耐药相关基因及相关位点突变不断被分析鉴定[19]，通过对相关耐药基因设计芯片进行检测，即可判断脊柱结核患者耐药情况，为患者选择有效药物治疗方案提供依据，也是治愈结核病、控制结核病流行的前提[20]。例如利福平耐药相关基因主要为rpoB[21]，Gingeras等[22]利用rpoB基因保守区705bp的核苷酸探针，对44株结核分枝杆菌利福平耐药分离株进行检测，发现了40株存在rpoB基因的突变，突变检出率为90.9%，表明基因芯片用于结核耐药检测的敏感性、特异性均较高，且检测结果与基因测序完全一致[23]，为后期患者进一步治疗提供参考。近年来国内外学者的研究已初步证实，基因芯片技术对结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药检测具有高度的准确性[24]，而且基因芯片耐药检测是基于DNA片段的检测，安全性高，开展性广。

1.3　核酸杂交

核酸杂交是指用标记的已知DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知核酸序列(形成异源双螺旋)，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。结核分枝杆菌基因组中含有特异的高度重复序列，将这些重复序列作为靶基因，用核酸杂交和PCR等技术对脊柱结核患者进行特异性检测就可达到基因诊断的目的[25]。目前主要核酸杂交技术包括膜上印迹杂交、斑点杂交、原位杂交。这些方法在临床诊断中都已得到应用，与脊柱结核的疾病诊断也密切相关[26]。LIANG等[27]采用反向斑点杂交技术分析鉴定37例脊柱结核术后患者病理组织或脓液抗酸染色阳性标本的分枝杆菌菌种，结果表明与传统诊断方法相比，核酸杂交技术可快速高效准确地鉴定脊柱结核分枝杆菌菌种，降低误诊漏诊率，同时为脊柱结核患者有效治疗争取了时间。核酸杂交技术简便、快速、灵敏，CHEN等[28]研究发现膜反向斑点杂交技术可以直接检测结核分枝杆菌katG、rpoB 基因突变，为临床检测结核分枝杆菌的耐药性提供辅助诊断手段，同时也为该技术的进一步推广，应用于其它的病原微生物及基因突变检测领域奠定了一定的实验基础。

目前的研究[29]表明，与传统药物敏感性检测方法相比，核酸杂交技术可在临床结核杆菌快速耐药检测中一次性对多种耐药基因的多种基因位点进行快速基因型鉴定，具有检测信息量大的特点，临床应用前景极大[30]。

2基因诊断的优缺点及展望

2000年人类基因组草图的公布，标志着现代医学的发展已进入“基因组医学”时代[31]。基因诊断技术虽然仅短短20多年历史，但发展迅速，在临床诊治中得到广泛应用。目前对于脊柱结核的实验室诊断主要依据细菌学检查，虽然细菌学检查是结核病确诊的金标准，但其培养周期长、繁琐费时、影响因素多，不能作为快速诊断方法。与之相比，基因诊断具有很突出的优点，主要包括：第一特异性高，通过选用特异性高的分子探针作为工具，可有针对性的检测样本特异表达基因的差异情况。第二灵敏度高，通过PCR技术，将检测的信号不断放大，即使是微量的样品也能得出精确的结果。第三稳定性和重复性好。第四，早期快速诊断性，只要外源基因进入或者基因发生变化，不管处于何种时期，都可以有效诊断，而且用时短，操作方便[32]。基因诊断的临床价值是值得肯定的，但近年来的临床实践也证明其仍具有一定的局限性。首先针对PCR技术缺点主要表现在假阳性[33]。PCR的敏感性极高,微量的污染即可导致假阳性的发生，这是PCR技术假阳性发生的最主要原因。所以在标本收集至整个操作过程中的各个环节必须保证严格的“无菌操作”，以避免污染；同时提高引物特异性也是避免假阳性发生的关键。而基因芯片虽然在结核耐药诊断研究中意义重大，但由于目前基因芯片技术尚不够完善，还在不断发展，特别是其价格昂贵、对操作的要求较高、重复性差等使其应用范围受到很大限制，这些问题主要需从样品的制备、探针合成固定、分子的标记等方面着手解决。

脊柱结核早期诊断可以有效预防患者并发症的出现，对于我国来说，面对结核病死灰复燃、脊柱结核病例逐年攀升的严峻挑战，对脊柱结核病的预防和早期诊断是一项非常值得探讨的重大课题。基因诊断作为新兴疾病诊断技术，近年来取得了重大进展，包括PCR、基因芯片以及核酸杂交等技术比传统方法更特异、敏感、快速，对临床鉴定及流行病学研究都产生了深远的影响。但是，由于技术上的难点和高昂的成本，基因诊断还存在着诸多缺点有待进一步解决和提高。客观地讲,限于目前的技术水平,基因诊断方法还不能完全替代常规诊断手段,它只是作为常规诊断的辅助方法。但随着基因组计划的深入开展和科技的不断发展，基因诊断技术将会更加完善并在临床上逐步得到普及。

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收稿日期：(2014-08-18)

作者简介：钟志伟(1986-)，男，硕士研究生，研究方向：脊柱外科；武汉(1967-)，男，博士，主任医师，教授，硕士生导师。

文章编号：1007-4287(2015)01-0165-04

通讯作者*

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30772209)