CXCR4启动子报告载体的构建

通信作者：殷小成(1969-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事儿科血液与免疫系统疾病的基础和临床研究。E|mail:xcyin108@sina.com

CXCR4启动子报告载体的构建

王艳1，李丹1，黄可1，殷小成2

(1.惠州市第一妇幼保健院儿科，广东 惠州 516001；2.南华大学附属第一医院儿科，湖南 衡阳 421001)

[摘要]目的构建并鉴定含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人CXCR4基因启动子的序列，构建报告载体PgL4.17|CXCR4，以其转染Jurkat细胞，然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的CXCR4启动子序列与克隆人PgL4.17|CXCR4的CXCR4启动子序列和GenBank报道的一致。实验组荧光素酶的表达活性是874 809.020 0±39 510.624 6，与空白组的465.900 0±26.250 1和对照组的37 981.980 0±2 384.341 2总体比较差异有统计学意义(F=4 678.919，P<0.001)。结论按照本实验方案，含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的PgL4.17|CXCR4报告载体被成功构建。

[关键词]CXCR4启动子；荧光素酶；报告载体；Jurkat细胞

基金项目：惠州市科技计划项目(编号：2014Y086)

作者简介：王艳(1978-)，女，硕士，主治医师，主要从事儿科血液系统恶性肿瘤的基础研究和临床工作。E|mail:wang13875678120@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.04.002

[中图分类号]R730.23

收稿日期：(2015-03-19)

Construction of Reporter Vector Containing Human CXCR4Promoter

Wang Yan1,Li Dan1,Huang Ke1,Yin Xiaocheng2

(1.DepartmentofPediatrics,theFirstWomenandChildren’sHospitalofHuizhou,Huizhou516001,China;2.DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversity,Hengyang421001,China)

Abstract[]ObjectiveTo construct and identify a luciferase reporter vector PgL4.17|CXCR4 containing human CXCR4 promoter.MethodsThe sequence of CXCR4 promoter gene was cloned,and was inserted into the reporter vector PgL4.17 to construct luciferase reporter vector PgL4.17|CXCR4,the recombinant plasmids were transfected into Jurkat cells.The luciferase activity was evaluated.ResultsCXCR4 promoter gene fragment was amplified by PCR.The insertion sequence of CXCR4 promoter in the experimental group was 874 809.020 0±39 510.624 6,was 465.900 0±26.250 1 in the blank group,and was 37 981.980 0±2 384.341 2 in the control group (F=4 678.919,P<0.001).ConclusionLuciferase reporter vector PgL4.17|CXCR4 containing human CXCR4 promoter can be constructed successfully.

[Key words]CXCR4promoter; luciferase; reporter vector; Jurkat cells

趋化因子受体CXCR4是基质细胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor|1，SDF|1)的惟一受体，SDF|1主要由骨髓基质细胞产生，两者特异性结合后在造血系统调控中起着重要的作用。SDF|1/CXCR4生物轴是指由SDF|1与其特异性受体CXCR4相互作用而构成的一个与细胞间信号转导、细胞迁移有密切关系的偶联分子对，该生物轴不但参与维持正常造血细胞的存活和增殖，而且与恶性细胞的增殖和血液、骨髓、淋巴结的浸润均有密切的关系[1]。SDF|1/CXCR4生物轴参与多种肿瘤的特异性转移，尤其在血液肿瘤浸润的病理过程中具有重要作用，因此，研究SDF|1/CXCR4生物轴已成为目前肿瘤研究的热点之一。本研究采用含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的PgL4.17|CXCR4表达载体转染Jurkat细胞，测定其荧光素酶的活性，旨在探讨基因重组技术对在以SDF|1/CXCR4生物轴为靶点的急性白血病的发生发展中的作用，并为靶向基因治疗提供依据。

1材料与方法

1.1实验材料人白血病Jurkat细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉)；E4550荧光素酶盒、荧光素酶报告基因表达载体PgL4.17、pGEM|T Easy克隆载体、dNTP、IPTG、X|gal、GloMax®96微孔检验仪均购自美国Promega公司；限制性内切酶Kpn I、Nhe I、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Marker DL2000均购自日本TaKaRa公司；脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNA提取试剂盒均购自Qiagen公司；G418、RPMI1640购自美国Gibco公司。

1.2实验方法

1.2.1CXCR4启动子引物合成依照GenBank中FJ642475 CXCR4启动子序列设计引物，该引物由上海生工生物公司合成，在引物的上游、下游中分别加入Kpn I、Nhe I酶切位点，上游引物为：5’|CGGTACCAAGCACTATTCGCGAATTGGTTAC|3’，下游引物为：5’|TGCTAGCGGTAACCGCTGGTTCTCCAGA|3’。产物大小为876 bp。

1.2.2CXCR4启动子序列扩增提取健康志愿者静脉血，分离外周血单个核细胞，提取人正常基因组DNA，以此为模版，采用设计的上下游引物，PCR扩增CXCR4启动子序列。PCR扩增体系：人基因组DNA 2 μL，高保真Taq酶2 u，上下游引物各0.5 mL，4×dNTP 2 μL，10×buffer 5 μL，去离子水补足50 μL，反应参数：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s，扩增循环25 次；最后72 ℃延伸5 min。取扩增产物5 μL行20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，256 nm紫外线灯下验证片段大小。

1.2.3报告载体的构建和鉴定扩增产物和PgL4.17报告基因载体，分别用Kpn I、Nhe I双酶切(37 ℃，2 h),琼脂糖凝胶电泳酶切产物，并用胶回收试剂盒回收和纯化。将纯化后的双粘片段和双粘的线性质粒PgL4.17直接与pGEM|T Easy载体进行连接，16 ℃连接过夜，转化感受态细菌DH5α，筛选阳性克隆，获得阳性报告载体PgL4.17|CXCR4，最后对扩增启动子片段进行碱基序列测定，鉴定阳性重组子的正确性。

1.2.4Jurkat细胞转染用体积分数10%胎牛血清RPMI1640培养基培养Jurkat细胞，将构建的重组质粒用脂质体法分别将PgL4.17、PgL4.17|CXCR4转入Jurkat细胞,在转染之前以3×105个/孔的细胞密度接种于24孔板上，在37 ℃、体积分数5% CO2和饱和湿度下培养，以浓度为600 mg·L-1G418进行筛选，2周后获得稳定Jurkat细胞转染株,然后在浓度为200 mg·L-1G418压力下再扩大培养。

1.2.5实验分组以未转染任何质粒的Jurkat细胞为空白组，以稳定转染PgL4.17质粒的Jurkat细胞为对照组，以稳定转染PgL4.17|CXCR4质粒的Jurkat细胞为实验组，分别以1×106个/孔的细胞浓度接种于6孔板上，每组设5个复孔，参照E4550荧光素酶试剂盒说明，用GloMax®96微孔检验仪检测以上分组萤光酶的荧光值，每孔至少重复3次，然后取平均值得出各组数值。

1.3统计学处理采用SPSS 16.0处理数据，3组萤光酶的荧光素酶活性的比较采用单因素方差分析和LSD|t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1人CXCR 4启动子序列的扩增结果用设计的引物行PCR扩增，获得人CXCR4启动子序列，琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段与目的片段理论值876 bp一致。

2.2人CXCR 4启动子荧光素酶表达载体的鉴定CXCR4启动子序列克隆入PgL4.17载体，筛选阳性克隆，经Kpn I、Nhe I双切酶电泳，琼脂糖凝胶电泳结果符合预计大小，DNA测序结果证实PgL4.17|CXCR4的插入序列与设计的完全一致。

2.3各组荧光素酶活性空白组荧光素酶活性为465.900 0±26.250 1，对照组荧光素酶活性为37 981.980 0±2 384.341 2，实验组荧光素酶活性为874 809.020 0±39 510.624 6，3组总体比较差异有统计学意义(F=4 678.919，P<0.001)。实验组荧光素酶活性高于空白组和对照组，比较差异有统计学意义(P<0.05)；对照组荧光素酶活性高于空白组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

CXCR4在急性白血病的原代细胞中均有不同程度的表达，其在急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病原代细胞均为高表达。国内学者曾东风等[2]在检测血液肿瘤中的相关因子表达中发现患者外周血SDF|1和骨髓表面CXCR4的表达均高于正常对照组，并且SDF|1、CXCR4之间的表达存在相关性，尤其是在急性淋巴细胞白血病原代细胞中的CXCR4高表达与其髓外浸润有关。国外学者Crazzolara等[3]在73例儿童急性淋巴细胞白血病的骨髓样本研究中发现，伴有髓外浸润的儿童急性淋巴细胞白血病细胞的CXCR4表达高于无浸润组，而且以发生多个部位的髓外浸润为特征的成熟急性淋巴细胞白血病中的CXCR4表达为最高，因此也认为在急性淋巴细胞白血病细胞中CXCR4呈现高水平表达均预示肿瘤有髓外浸润的倾向。CXCR4是急性淋巴细胞白血病细胞中检测到的表达最强的趋化因子受体，CXCR4是SDF|1的惟一受体，尤其是在急性淋巴细胞白血病原代细胞的表达明显高于正常对照组。

PgL4.17作为荧光素酶的报告基因载体，既不含启动子，也不含增强子，可以用于定量分析调节哺乳动物基因表达的各种因子的活性，并且提供了理论基础[4-5]。基于荧光素酶蛋白费用低、灵敏度高、半衰期比较短、检测时间短、不使用放射性同位素等特点，本实验采用改建后的PgL4.17载体，利用插入的抗性基因作为筛选标志物，更加有利于筛选哺乳动物细胞基因中稳定表达的各种的活性因子。本研究不但成功构建和鉴定了PgL4.17|CXCR4报告载体，而且还证实了重组质粒PgL4.17上的多克隆位点；实验中参照GenBank设计了扩增目的基因片段引物，该引物上下游含有相同的Kpn I、Nhe I 2个酶切位点，实验显示这样目的片段不但可以出现双粘接头的形式，而且还可以按照正确的方向插入构建的表达载体。

本研究结果显示：在构建的表达质粒稳定转染Jurkat细胞后，重组质粒上游启动子序列的将调节转染细胞中的荧光素酶的表达，并且荧光素酶活性可以用来直接反应启动子的强度。我们分别将PgL4.17、PgL4.17|CXCR4转染Jurkat细胞，培养后测定荧光素酶活性，发现转染PgL4.17|CXCR4的Jurkat细胞较转染PgL4.17组的Jurkat细胞明显升高，本实验成功构建了CXCR4启动子荧光素酶表达载体，从而为进一步以SDF|1/CXCR4生物轴为靶分子的急性淋巴性白血病的治疗提供新的研究思路。

参考文献：

[1]Juarez J,Bendall L.SDF|1 and CXCR4in normal and malignant hematopoiesis[J].Histol Histopathol,2004,19(1):299-309.

[2]曾东风，孔佩艳，陈幸华，等.SDF|1及其受体CXCR4在急性白血病与淋巴瘤表达的初步研究 [J].中国实验血液学杂志,2005，13(2)274-277.

[3]Crazzolara R,Kreczy A,Mann G,et al.High expression of the chemokine receptor CXCR4predicts extramedullary organ infiltration in childhood acutelymphoblastic leukaemia[J].Br J Haematol,2001,115(3):545-553.

[4]Li W,Gao L,Wang Y,et al.Enhancement of cortisol|induced 11beta|hydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression by interleukin 1beta in cultured human chorionic trophoblast cells[J].Endocrinology,2006，147(5):2490-2495.

[5]Yeung CM,Chan CB,Woo NY,et al.Seabream ghrelin: cDNA cloning,genomic organization and promoter studies[J].J Endocrinol,2006,189(2):365-379.