miR-20b直接靶向3′-UTR负性调节VEGF的表达*

陶象男，　汪忆梦，　宋传旺△

1蚌埠医学院第二附属医院检验科，蚌埠　233040

2蚌埠医学院免疫学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠　233030



miR-20b直接靶向3′-UTR负性调节VEGF的表达*

陶象男1，汪忆梦2，宋传旺2△

1蚌埠医学院第二附属医院检验科，蚌埠233040

2蚌埠医学院免疫学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠233030

摘要：目的探讨miR-20b是否直接靶向VEGF 3′-非编码区(3′-UTR)而调控其表达。方法采用miRanda软件预测VEGF 3′-UTR是否存在miR-20b的结合位点；使用PCR方法扩增RAW264.7细胞VEGF基因3′-UTR序列，经双酶切后克隆到pmiR-RB-ReportTM质粒海肾荧光素酶的下游，得到pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR双荧光素酶重组质粒，使用电泳法和测序法进行验证；将重组质粒或空质粒与miR-20b模拟物或其对照共转染HeLa细胞，24 h后检测相应荧光素酶活性。结果VEGF 3′-UTR存在miR-20b的结合位点；获得了含VEGF 3′-UTR的双荧光素酶报告载体；重组质粒与miR-20b模拟物共转染组HeLa细胞的荧光素酶活性明显低于空质粒转染组(P<0.05)。结论成功构建小鼠VEGF基因3′-UTR双荧光素酶报告载体，miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而负性调控其表达。

关键词：血管内皮生长因子；3′-非编码区；miR-20b；双荧光素酶报告载体

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在生理性和病理性的血管生成中均起到重要作用，对于血管内皮细胞来说，它是一种分泌性的有丝分裂原，是最具潜能的促血管生成因子[1]。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、PIGF-1和PIGF-12等8个成员，VEGF-A即通常我们所指的VEGF，它是含有二硫化物的同源二聚体糖蛋白[2]。VEGF与肿瘤、脓毒症、糖尿病、类风湿关节炎等多种疾病有密切的联系[3]，而最近的研究表明，VEGF在哮喘的发病中也起到了关键作用，并且VEGF的表达水平与疾病的进展与预后相关[4]。VEGF表达的调控既可以发生在转录水平，也可以发生在转录后水平，HIF-1、STAT3、SP-1等多种转录因子已被证明可调控VEGF的表达[5]，但关于其转录后水平调控的研究较少。目前microRNA(miRNA)在哮喘发病中的作用已引起了人们的关注，我们前期的研究表明，慢性哮喘小鼠肺组织中miR-20b的表达较正常小鼠减少，并且miR-20b可以负性调节VEGF的表达[6]。但miR-20b究竟通过何种机制调控VEGF表达仍不清楚。本研究通过miRanda软件预测VEGF 3′-UTR是否存在miR-20b的结合靶点，并构建含有VEGF基因3′-UTR(Untranslated Regions，非编码区)的双荧光素酶报告载体，以观察miR-20b是否在转录后水平直接靶向VEGF而调控其表达。

1材料和方法

1.1材料

pmiR-RB-ReportTM质粒(6 720 bp)购于广州锐博公司，大肠埃希菌DH5α购自碧云天公司，Dual-Luciferase©Reporter Assay System购于Promega公司，LipofectamineTM2000、Trizol试剂由Invitrogen公司提供，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase试剂盒、TransScriptTMFirst-strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒购于北京全式金公司，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购于康宁公司，DNA连接酶、XhoⅠ、NotⅠ内切酶购自TaKaRa公司。miR-20b模拟物及其对照购于上海吉玛公司，miR-20b模拟物序列(上游：5′-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3′，下游：5′-ACCUGCACUAUGAGCACUUUGUU-3′)，miR-20b模拟物对照序列(上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。

1.2方法

1.2.1小鼠VEGF基因3′-UTR序列的扩增采用Trizol试剂提取RAW 264.7细胞总RNA，根据TransScript First-strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒说明书进行第一链cDNA合成，然后进行PCR扩增VEGF基因3′-UTR序列，由于VEGF 3′-UTR下游多聚A信号较长，不利于克隆，而miRNA的结合位点多集中在上游300 bp以内，因此我们设计的引物最后扩增的是VEGF 3′-UTR上游约350 bp长度的序列。设计的上游引物：5′-CCGCTCGAGGCCAGGCTGCAGGAAGGAG-3′，下游引物：5′-GAATGCGGCCGCGTGTATGTGG-GTGGGTGTGTC-3′。其中上游引物下划线处为XhoⅠ酶切位点，下游引物下划线处为NotⅠ酶切位点，扩增产物长度334 bp。PCR反应遵照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase试剂盒说明书进行，反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性20 s，57℃退火20 s，72℃，延伸30 s，40个循环。

1.2.2pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR双荧光素酶重组质粒的构建将pmiR-RB-ReportTM质粒与回收纯化的VEGF基因3′-UTR序列PCR扩增产物进行XhoⅠ、NotⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收纯化。按照TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0说明书进行连接反应，连接产物转化感受态DH5α进行扩增培养，浓集菌液后抽提重组质粒。重组质粒进行XhoⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并送上海生工测序。

1.2.3细胞的转染转染前1 d，将HeLa细胞(2×105/孔)接种24孔板，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)培养，转染当天细胞约70%~90%融合。按照LipofectamineTM2000说明书进行转染，用250 μL Opti-MEMⅠ稀释3 μL 20 μmol/L miR-20b模拟物及其对照储存液(V1)，用100 μL Opti-MEMⅠ稀释3 μL Lipo2000(V2)，用150 μL Opti-MEMⅠ稀释1 μg质粒(V3)，将V1、V2、V3溶液混合，轻轻混匀，室温孵育20 min；将转染复合物(V1+V2+V3)加入HeLa细胞(500 μL)在培养箱中培养4~6 h，更换含10%血清的DMEM完全培养液，继续培养24 h后进行荧光素酶活性的测定。实验分4组：①pmiR-RB-ReportTM空载体+miR-20b模拟物；②pmiR-RB-ReportTM空载体+miR-20b模拟物对照；③pmiR-RB-ReportTM-VEGF-3′-UTR重组载体+miR-20b模拟物；④pmiR-RB-ReportTM-VEGF-3′-UTR重组载体+miR-20b模拟物对照。

1.2.4荧光素酶活性的检测按照Promega公司的双荧光素酶活性检测试剂盒说明书进行。检测前用1×PBS洗涤HeLa细胞2~3次，每孔(24孔板)加入150 μL新鲜配制的被动细胞裂解液，反复吹打，使细胞充分裂解；13 000 g离心1 min取上清，在96孔非透明板中进行荧光素酶活性的测定，每孔加入20 μL上清，然后加入100 μL LARⅡ，检测萤火虫荧光素酶荧光值，再加100 μL Stop & Glo©试剂，检测海肾荧光素酶的荧光值。测量时，使用1~2 s延迟和5~10 s读数。最后的荧光素酶活性以海肾荧光素酶的荧光值与萤火虫荧光素酶荧光值之比表示。

1.3统计学处理

2结果

2.1miRanda软件预测VEGF 3′-UTR存在miR-20b的结合位点

根据miRBase网站(http：//www.mirbase.org/)数据，小鼠miR-20b结合靶基因3′-UTR的种子区域序列是AAAGUGC，其互补区序列应是GCACUUU，按照miRanda算法(http：//www.microrna.org/microrna/home.do)显示，在VEGF 3′-UTR上游处存在GCACUUU序列，是miR-20b结合的一个靶点，如图1。

图1　miRanda算法预测VEGF 3′-UTR的miR-20b结合位点Fig.1 Prediction of binding sites of miR-20b to 3′-UTR in VEGF gene using miRanda algorithm

2.2pmiR-RB-ReportTM-VEGF-3′-UTR重组质粒的构建

我们以RAW 264.7细胞为模板，扩增VEGF基因3′-UTR序列，产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，PCR扩增长度大小约334 bp，与设计相符。将PCR扩增产物克隆到pmiR-RB-ReportTM质粒海肾荧光素酶的下游，得到pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR双荧光素酶报告载体，重组质粒XhoⅠ、NotⅠ酶切签定结果如图3，在334 bp处有一条带，说明VEGF 3′-UTR序列扩增产物被成功克隆到pmiR-RB-ReportTM质粒。重组质粒测序结果如图4，VEGF 3′-UTR插入方向正确，序列也与GenBank数据库一致。因此，pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重组质粒成功构建。

M：100 bp DNA ladder；1：VEGF 3′-UTR PCR扩增产物图2　VEGF基因3′-UTR PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoregram of PCR amplification products of 3′-UTR in VEGF gene

M1：DL 10 000 bp DNA marker；1：pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重组质粒；2：重组质粒XhoⅠ酶切签定；3：重组质粒XhoⅠ和NotⅠ双酶切签定；M2：100 bp DNA ladder图3　pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重组质粒酶切鉴定图Fig.3 Identification of pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR recombinant plasmid by enzyme digestion

图4　pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR重组质粒部分测序图Fig.4 Map for partial sequences of pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR recombinant plasmid

2.3荧光素酶活性检测的结果

本研究体系使用的报告基因检测系统是pmiR-RB-ReportTM质粒(图5)，与其他双荧光素酶报告载体不同，它的报告基因是海肾荧光素酶(hRLuc)，内参基因是萤火虫荧光素酶(hLuc)，因此最后的荧光素酶活性检测结果以hRLuc/hLuc表示，结果如图6，重组质粒+miR-20b模拟物共转染组HeLa细胞的荧光素酶活性明显低于空质粒+miR-20b模拟物及空质粒+miR-20b对照共转染组(均P<0.05)，而重组质粒+miR-20b对照共转染组荧光素酶活性与2个空质粒共转染组相比差异无统计学意义。这说明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而负性调节其表达。

3讨论

VEGF是内皮细胞特异的有丝分裂原，在血管发生中起到关键作用。VEGF也可以增加血管的通透性而引起肺部炎症，Lee等[7]证明VEGF是引起哮喘发病的主要决定因素。多项研究表明临床哮喘患者血清及痰液中VEGF的表达升高，并且其病情严重程度与VEGF表达的量呈正相关[8-9]。因此关于VEGF表达调控的研究异常重要，目前此方面的研究多集中在转录水平，而关于转录后水平调控VEGF表达的研究较少。

hLuc：萤火虫荧光素酶内参基因;hRLuc：海肾荧光素酶报告基因;miR Target Gene 3′-UTR：miRNA靶基因的3′-UTR序列图5　pmiR-RB-ReportTM质粒结构示意图Fig.5 Structure diagram of pmiR-RB-ReportTMplasmid

①空质粒+miR-20b模拟物；②空质粒+miR-20b对照；③重组质粒+miR-20b模拟物；④重组质粒+miR-20b对照;与空质粒对照组比较*P<0.05图6　miR-20b对pmiR-RB-ReportTM报告基因系统荧光素酶活性的影响Fig.6 Effect of miR-20b on the luciferase activity of pmiR-RB-ReportTMreporter gene system

本研究旨在观察microRNA是否可在转录后水平直接靶向VEGF 3′-UTR而调控其表达，实验结果表明：miRanda软件从理论上分析出VEGF 3′-UTR存在miR-20b的结合位点，通过构建的含VEGF 3′-UTR的双荧光素酶报告载体，证明miR-20b模拟物抑制了pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR双荧光素酶重组质粒报告基因的活性，这说明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而调控其表达。

荧光素酶有很多种，最常应用的是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，前者的发射波长是562 nm，后者的发射波长是460~540 nm。常规的荧光素酶报告系统的检测，是向系统中同时或分开转染独立含单荧光素酶的质粒，但每种质粒的结构、大小、特点都不同，再加上靶细胞的状态、数目等因素，会相互影响转染的效率，而最终的结果是计算报告荧光素酶活性与内参荧光素酶活性的比值，转染效率的差异会影响实验结果的准确性。在我们的实验体系中，使用的是同时含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的pmiR-RB-ReportTM双荧光素酶报告载体，这就避免了2种质粒转染所造成的转染效率的差异，提高了实验的精度和重复性，我们的实验结果即表明同组不同复孔之间差异较小。因此使用这种双荧光素酶报告基因的检测系统正成为一种趋势。

miRNA是一种小片段非编码RNA，它可以在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA的调控依赖其5′端约7个核苷酸长度的种子区域与靶基因3′-UTR互补序列的结合，这种结合会导致靶基因mRNA翻译的受抑或降解[10-12]。Collison等[13]在最近的研究显示，使用miR-126的拮抗剂抑制了变应性哮喘小鼠的气道高反应性等表型特点。我们前期的研究也显示哮喘小鼠肺泡巨噬细胞miR-20b的表达下调。miR-20b是miR-106a-363基因簇成员，定位在X染色体，目前相关研究很少。Lei等[14]的研究显示肝癌细胞中，miR-20b可以调节VEGF的表达。Cascio等[15]的研究进一步表明miR-20b可以通过靶向HIF-1与STAT3间接调控VEGF的表达。本研究使用miRanda算法预测到VEGF 3′-UTR含有miR-20b种子区域的互补序列，并通过miRNA靶基因3′-UTR双荧光素酶质粒载体技术证明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而调控其表达。我们的实验与Cascio等的结果表明miR-20b既可以直接靶向VEGF，也可以通过调节HIF-1与STAT3等转录因子间接负向调节VEGF的表达。

综上所述，本研究成功构建了pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR双荧光素酶重组质粒，并证明miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而负性调节其表达，这将为临床哮喘治疗发现新靶点提供理论和实验依据。

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(2015-03-19收稿)

miR-20b Directly Targets 3′-untranslated Region of VEGF and Negatively Regulates Its Expression

Tao Xiangnan1，Wang Yimeng2，Song Chuanwang2△

1DepartmentofClinicalLaboratory，TheSecondAffiliatedHospitalofBengbu

MedicalCollege，Bengbu233040，China2DepartmentofImmunology，AnhuiProvincialKeyLaboratoryofInfectionandImmunity，BengbuMedicalCollege，Bengbu233030，China

AbstractObjectiveTo investigate whether miR-20b directly targets VEGF 3′-untranslated region(3′-UTR) and regulates its expression.MethodsMiRanda software was used to predict the binding sites of miR-20b to VEGF 3′-UTR.3′-UTR sequence of VEGF gene was amplified using polymerase chain reaction(PCR) in RAW264.7 cells.PCR products were cloned into the downstream of Renilla luciferase in pmiR-RB-ReportTMplasmid to obtain pmiR-RB-ReportTM-VEGF 3′-UTR recombinant vector.Electrophoresis and DNA sequencing methods were used to verify the recombinant plasmid.The recombinant plasmid or empty plasmid and miR-20b mimic or its control were co-transfected into HeLa cells and 24 h later，the corresponding luciferase activity was detected by Dual-Luciferase©Reporter Assay System.ResultsThe recombinant dual luciferase reporter vectors with VEGF 3′-UTR were acquired.There was a binding site of miR-20b to 3′-UTR of VEGF gene.The luciferase activity in HeLa cells transfected with recombinant plasmid and miR-20b mimics was significantly lower than in the empty plasmid group(P<0.05).ConclusionMouse VEGF gene 3′-UTR dual luciferase reporter vector was successfully constructed.miR-20b could directly target VEGF gene 3′-UTR and negatively regulate its expression.

Key wordsvascular endothelial growth factor；3′-untranslated region；miR-20b；dual luciferase reporter vector

中图分类号：R392.3

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.005

通讯作者△，Corresponding author，E-mail：chuanwangsong@163.com

*国家自然科学基金资助项目(No.81273273)；安徽省自然科学基金资助项目(No.1308085MH114)

陶象男，女，1987年生，硕士研究生，E-mail：taoxiangnan@aliyun.com