构建表达膜锚定荧光素酶的载体实现细胞自发光成像*

陆 琤 张 硌 张 鹏*

荧光素酶(luciferase)是一类能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶。根据来源不同，荧光素酶可分为细菌荧光素酶(bacterial luciferase，BL)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)、海肾荧光素酶(renilla luciferase，RL)和其他新型低分子量荧光素酶如Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase，GLuc)等。

GLuc是从海洋桡足类动物Gaussia princeps中发现的一种荧光素酶，分子量为19.9 kD，是自然分泌的已知最小的荧光素酶[1]。GLuc的N端有17个氨基酸残基的分泌信号肽，因此可以分泌至细胞外。GLuc可催化天然腔肠素发生发光反应，发射光波长峰值为480 nm。体内实验表明，GLuc产生光子的强度比RLuc高200倍，与FLuc产生的光子强度相当[2]。但GLuc发光信号衰减迅速，在一定程度上限制了其应用。使用通过密码子优化的GLuc，适合哺乳动物细胞表达，不仅能延长发光信号半衰期，而且能极大提升发光强度[1，3]。

构建能表达荧光素酶的细胞，相当于给细胞加上可以实时监测的标签，如将该细胞经腹腔或静脉注射小鼠体内，当外源(腹腔或静脉注射)给予其底物时，可在数分钟内产生发光现象，即可追踪细胞在活体内的位置，实现在无创条件下对体内生物现象进行实时监测[4]。但是天然的荧光素酶为分泌型，需将其锚定在细胞膜上才能指示细胞。本研究通过对密码子优化的GLuc进行改造，使用表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，MCSFR)以及广泛存在于细胞表面的白细胞介素4受体α链(interleukin 4 receptorα，IL4Rα)的信号肽(signal peptide，SP)替换GLuc的信号肽，再在GLuc后加上EGFR、MCSFR及IL4Rα跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)，并在其3'末端加上终止密码子。如此设计的目的序列，能使表达的GLuc锚定在细胞表面，从而实现指示细胞位置的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

采用Tanon 5200型全自动化学发光成像分析系统(中国天能公司)；0.22 m型滤器(美国PALL公司)；超滤离心管(美国Millipore公司)；包装质粒PMD和SPA为本实验室保存，载体质粒PCDH-X本实验室保存。DNA片段GLuc-EGFR、GLuc-MCSFR、GLuc-IL4Rα的合成及将其分别插入到PCDH-X载体质粒上由苏州泓讯生物科技股份有限公司完成。293TX细胞为本实验室保存；永生化外周血来源巨噬细胞iBloodMC为本实验室构建。荧光素酶底物Coelenterazine购自Nanolight公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen Life Technologies公司；高糖培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培养基购自美国Gibco公司；血清购自Hyclone；其余常用试剂均为国产分析纯。

1.2 表达膜锚定荧光素酶慢病毒载体构建

目标序列设计方法：用广泛存在于细胞表面的人源EGFR、MCSFR及IL4Rα的SP替换GLuc的SP，除去GLuc3'端的终止密码子，在其后再加上EGFR、MCSFR及IL4Rα跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)，并在其3'末端加上终止密码子，目的序列设计完成。用全基因合成的方法将目的序列插入PCDH-X载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，载体名称分别为PCDH-GLuc-EGFR、PCDHGLuc-MCSFR及PCDH-GLuc-IL4Rα，目的序列结构见图1。

1.3 表达膜锚定荧光素酶的慢病毒包装

293TX细胞于对数生长期时接种于60 mm直径的皿中，用含10%血清的1640培养基培养。将1 μg PMD、3 μg SPA、4 μg PCDH-X、PCDH-GLuc-EGFR、PCDH-GLuc-MCSFR及PCDH-GLuc-IL4Rα分别与100 μl无血清1640温和混匀，16μl Lipofectamine 2000与100 μl无血清1640温和混匀，室温静置5 min后将二者混匀，室温静置20 min，将混合液缓慢滴入293TX细胞中，即完成病毒包装。病毒包装后8 h或过夜后换液，24～36 h收一次上清，补液5 ml。约72 h后再收上清，以3000 r/min，离心5 min，使得细胞及杂质沉淀，取上清用0.22 μm滤器过滤后加入Millipore超滤离心管，以5000 r/min，离心20 min，获得约200 μl浓缩病毒，置于-40 ℃保存或立刻使用。

1.4 永生化外周血来源巨噬细胞培养及感染

取少量永生化小鼠外周血来源巨噬细胞iBloodMC，接种至12孔板中的4孔，分别加入PCDH-X、PCDHGLuc-EGFR、PCDH-GLuc-MCSFR和PCDHGLuc-IL4Rα浓缩病毒约20 μl，感染72 h左右，加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞，终浓度为5 ng/ml。筛选3～4 d后更换培养液。待感染成功的细胞长满后，在倒置荧光显微镜下观察后将其扩大培养。4种细胞分别命名为iBloodMC CON、iBloodMC GLuc-EGFR、iBloodMC GLuc-MCSFR和iBloodMC GLuc-IL4Rα。

1.5 细胞体外成像检测

将处于对数生长期的iBloodMC GLuc细胞，铺入96孔板中，每种细胞各铺一个孔，每孔约铺1×104个细胞。每孔加入100 μl培养基，置于37 ℃ 5%的CO2培养箱中培养48 h，吸出50 μl培养上清移入下一排的孔中，使细胞及其培养上清上下对应，其余培养上清弃之，PBS漂洗细胞3遍。加入荧光素酶发光底物，终浓度为50 μM，混匀，等待1 min后使用发光成像系统检测。

2 结果

2.1 慢病毒感染永生化小鼠外周血来源巨噬细胞结果

由于载体PCDH能表达绿色荧光蛋白，因此慢病毒感染成功的细胞在荧光显微镜下均应发绿光。实验中慢病毒感染成功的细胞经荧光显微镜镜检均显示为绿色荧光，见图2。

图2 慢病毒感染成功细胞荧光显微镜下图(×20)

2.2 发光成像结果

将4种细胞及其培养上清加入荧光素底物后，使用Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统成像，iBloodMC GLuc-EGFR、iBloodMC GLuc-MCSFR和iBloodMC GLuc-IL4Rα均能表达荧光素酶。其中，iBloodMC GLuc-EGFR荧光素酶表达量最高，且膜锚定效果最好；iBloodMC GLuc-IL4Rα荧光素酶表达量次之，膜锚定效果与iBloodMC GLuc-EGFR相比稍差；iBloodMC GLuc-MCSFR荧光素酶表达量较少，见图3。

图3 四种表达荧光素酶细胞发光成像图

3 结论

生物发光常见于一些特定的细菌、昆虫和海洋生物中，其过程是通过荧光素酶催化底物荧光素产生发光反应，具有非放射性、反应灵敏、操作简单、结果准确、无毒副作用等优点，因而广泛应用于分子生物学、医学等研究领域[6-7]。如将荧光素酶基因融合哺乳动物表达载体，并包装成病毒感染肿瘤细胞稳定表达，使该肿瘤细胞成为发光源，用其建立新型的肿瘤动物模型，能够通过活体成像系统实时、无创地监控肿瘤的生长和转移[8-10]。

GLuc是荧光素酶的一种，在多种哺乳动物细胞中均能高效的分泌表达，且其催化底物产生发光反应不需要三磷酸腺苷(adenosin triphosphate，ATP)参与，即不需要裂解细胞提供ATP，可在保持细胞完整的情况下，通过检测GLuc从而监测细胞的情况，且检测过程方便快捷。因此，本实验研究选用GLuc来实现细胞自发光。

本研究通过慢病毒感染的方法将高斯荧光素酶基因整合至永生化的小鼠外周血来源巨噬细胞中，且通过改造该荧光素酶基因，利用广泛表达于细胞表面的3种受体，使其不能分泌至细胞外而锚定在细胞膜上。当在培养细胞的孔里和细胞培养上清中分别加入荧光素酶底物，如存在GLuc，GLuc催化底物反应，用成像系统拍摄出来呈黑色，黑色越深，GLuc含量越高。实验结果显示，在iBloodMC Gluc-hEGFR的细胞培养上清中几乎检测不到GLuc，而在培养该细胞的孔中能检测到GLuc，且颜色较深。若GLuc存在于细胞内，由于荧光素酶底物不能透过活细胞膜进入细胞内与GLuc反应，因此这些GLuc不可能存在于细胞内，而是被锚定在细胞膜表面。从这三种细胞及细胞培养上清显示的黑色深浅表明，iBloodMC Gluc-hEGFR分泌的GLuc最多，且细胞自发光成像效果最好，iBloodMC Gluc-IL4Rα次之，iBloodMC Gluc-MCSFR最差，后续实验不可采用。而iBloodMC Gluc-EGFR、iBloodMC Gluc-IL4Rα由于自发光成像效果较好，后续可工程化改造成可用于治疗特定疾病的细胞，当将该细胞注射入体内时，可通过GLuc实时监测治疗细胞的位置，为有效监测该治疗细胞在体内的情况提供一种可靠的方法。