产β-葡聚糖酶黑曲霉固态孢子增殖工艺研究

2015-01-21张建华王德培

饲料工业 2015年22期

■张建华黄娟李昆于淼侯莉王德培

（工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

黑曲霉在生长过程中会产生各种水解酶,其中农业部允许使用的酶制剂目录中，11种可由该菌生产，分别是淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、蛋白酶、木聚糖酶。β-葡聚糖酶是纤维素酶酶系的重要组成部分，该酶最先用于啤酒工业分解大麦中β-1,3和β-1,4糖苷键，可降低麦汁黏度，提高麦汁的过滤速度和出汁率，改善啤酒质量。在大麦等谷物及糠麸饲料中添加β-葡聚糖酶可消除β-葡聚糖的抗营养作用,使其失去亲水性和黏性、改变单胃动物肠道内容物的黏度及消化酶的活性,提高饲料利用率、畜禽的生长性能及整齐度，对于改善饲料的营养价值,提高禽畜的生产性能具有重要意义。国内目前对发酵生产β-葡聚糖酶的研究，主要是以芽孢杆菌或黑曲霉为材料。黑曲霉在液体培养中是不产孢的，只有在固体培养基上产孢。在工业发酵领域中，菌株的扩大培养是发酵工艺的重要环节，目前孢子扩培主要应用麸皮固态培养，机械化程度最低，劳动密集度高，而且培养时间长，生产效率低。为了提高黑曲酶产孢量，本文采用人工合成固态培养法生产黑曲霉孢子,此方法孢子生长速度快，产孢量大，可实现机械化生产等优点。本文对黑曲霉（Aspergillus niger）TCCC 41649菌株产β-葡聚糖酶的最适产孢培养基进行了优化研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉（A.niger）TCCC 41649，由天津科技大学微生物保藏中心保藏。

1.2 试剂

葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、草酸铵、柠檬酸铵、KH2PO4、MgSO4·7H2O、Zn⁃SO4·7H2O、MnCl2均为国产分析纯试剂。

1.3 培养基

1.3.1 斜面培养基

PDA培养基：称取已去皮的马铃薯200 g，加水500 ml加热煮沸30 min，四成纱布过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂粉20 g溶液定容至1 000 ml，pH值自然，趁热分装于500 ml三角瓶，每瓶50 ml左右，121℃、灭菌20 min后取出，搁置成斜面，冷却至室温备用。

1.3.2 基础固体培养基

基础产孢培养基：磷酸二氢钾1.5 g/l、硫酸铵5 g/l、麦芽糖 15 g/l、硫酸镁0.5 g/l、硫酸锌0.01 g/l、氯化锰0.06 g/l、琼脂粉20 g/l，pH值自然，121 ℃、20 min灭菌。

1.4 试验方法

1.4.1 培养方法

500 ml的三角瓶中加入150 ml的固体培养基，以接种量为103个孢子接入三角瓶中，35℃培养箱中静置培养96 h后洗出孢子涂平板计数。

1.4.2 孢子悬液的制备

用加有0.1%吐温80及玻璃珠的100 ml无菌水将三角瓶中培养96 h的黑曲霉孢子洗出，再经过适当稀释后进行涂布。

1.4.3 孢子计数

通过平板单菌落计数，计算得出三角瓶中103个孢子的最终产孢总数。

1.5 培养条件的优化

1.5.1 接种量的选择

选择基础固体产孢培养基，培养基体积为150 ml，设定不同接种量102～105个孢子，接种于三角瓶中进行孢子增殖培养。比较不同接种量对孢子增殖的影响，确定最适接种量。

1.5.2 培养基体积的选择

选择基础固体产孢培养基，分别在三角瓶中加入100～300 ml的培养基，以最适的接种量接种孢子，比较不同培养基体积对孢子增殖的影响，确定最适培养基体积。

1.6 固体产孢培养基的优化

1.6.1 碳源的优化

选择30.0 g/l的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖作为碳源，在已优化的最适培养条件下培养，比较不同碳源对孢子增殖的影响，确定最适碳源。加入30.0～65.0 g/l的最适碳源，确定最适碳源的最优质量浓度。

1.6.2 氮源的优化

以最适质量浓度的碳源为培养基基本组分，无机氮源添加量以氮元素摩尔数相等为依据，总氮元素含量为1.0 g/l条件下，加入不同种类无机氮源，比较其对产孢的影响，确定最适无机氮源。加入含氮量分别为1.0～5.0 g/l最适无机氮源，确定最适无机氮源的最优质量浓度。

1.6.3 KH2PO4对孢子增殖的影响

以最优质量浓度的碳源、氮源为培养基的基本组分，基础培养基中加入浓度分别为0.2～2.5 g/l KH2PO4，在最适的培养条件下进行孢子增殖培养，确定最优的KH2PO4浓度。

1.6.4 MgSO4对孢子增殖的影响

以最优质量浓度的碳源、氮源、KH2PO4为培养基的基本组分，加入浓度分别为0.1～2.5 g/l MgSO4，在最优的培养条件下进行孢子增殖培养，确定最优的MgSO4浓度。1.6.5 正交试验

利用 L9(34)正交试验筛选出KH2PO4、MgSO4、ZnSO4和MnCl2的最佳配比。

2 结果与讨论

2.1 培养条件的优化

2.1.1 接种量对孢子增殖的影响(见图1)

图1 接种量对孢子增殖的影响

在一定空间内接种量小，氧供给充足，会导致菌体代谢旺盛而产孢率低。相反接种量过大会导致氧气不充足，使菌体生长缓慢且形成无氧代谢产物，不利于孢子增殖。

500 ml三角瓶相同培养基条件接入不同孢子量对孢子最后增殖影响较大，如图1所示，当接种量为103个孢子时，单孢产孢量最高达4.67×106个，随着接种量增加，产孢量却随之下降。研究可知，由于菌体相对密度增大，导致生长时所需培养基内溶氧不足，菌体生长状态不良，从而使产孢量降低，所以本试验选取103个孢子为最适接种量。

2.1.2 培养基体积对孢子增殖的影响（见图2）

图2 培养基体积对孢子增殖的影响

溶解氧的大小对菌体生长、产物的形成及产孢量都会产生不同的影响，由于氧在固体中溶解度很小，黑曲霉生长过程中，基内菌丝的氧获得都来自于固体培养基，固体培养基内溶解氧的多少与固体培养基体积成正比，同样在500 ml三角瓶相同接种量下，不同体积培养基孢子增殖影响显著。

由图2结果显示，当培养基体积为150 ml时，单孢产孢量最大为4.57×106个孢子。当培养基体积为100 ml时，由于溶氧不足，菌体生长缓慢导致产孢量不高。培养基体积在150 ml以上时，随着培养基体积的增加，产孢量下降。所以本试验选取150 ml为最适培养基体积。

2.2 培养基的优化

2.2.1 碳源的筛选（见图3～图4）

黑曲霉产孢通常以麸皮作为培养基，由于麸皮其本身成分波动较大，孢子生长缓慢需要7 d，严重影响孢子生长速度和增殖数量，而且不利于自动化操作，因此试验选取不同碳源进行黑曲霉产孢。

由图3可知，四种碳源对黑曲霉产孢量的影响先后顺序为麦芽糖＞葡萄糖＞蔗糖＞果糖，麦芽糖、葡萄糖明显优于其他碳源，这是因为不同碳源对微生物生长有着不同的影响，能够为菌体快速吸收利用的碳源有利于活菌数和孢子产量的提高。由于麦芽糖和葡萄糖对黑曲霉产孢影响效果差别不大，考虑成本因素选取葡萄糖为最适碳源。葡萄糖最优质量浓度试验结果如图4所示。

图3 碳源对孢子增殖的影响

图4 葡萄糖浓度对孢子增殖的影响

当葡萄糖浓度为30.0～40.0 g/l时，黑曲霉产孢量呈现上升趋势；之后随着添加量的继续增大，产孢量开始下降。开始时曲线升高趋势明显，这与碳源对黑曲霉的作用方式有关，增加碳源含量有利于菌体的快速繁殖。但碳源浓度超过40.0 g/l后，由于营养过剩，黑曲霉菌体过大，产孢量明显减少。因此试验中选取40.0 g/l为葡萄糖的最适质量浓度。

2.2.2 无机氮源的筛选（见图5～图6）

从生长角度看，黑曲霉可以利用很多无机氮源，试验中选取5种常用的无机氮源。由图5可知，（NH4）2SO4单孢产孢量明显比其他种类的无机氮源高，单孢产孢量达6.67×106个，因此本试验选取（NH4）2SO4作为最适无机氮源。

当硫酸铵浓度为3.0 g/l时，单孢产孢量达到最高为4.56×106个孢子，故本试验选取3.0 g/l的硫酸铵为最适无机氮源浓度。

图5 无机氮源对孢子增殖的影响

图6 硫酸铵浓度对孢子增殖的影响

2.2.3 KH2PO4对孢子增殖的影响（见图7）

图7 KH2PO4对孢子增殖的影响

磷酸盐对微生物产酶的作用是非常重要的，磷是细胞合成核酸必需的一种元素，也是加快吸收葡萄糖、促进细胞生长不可或缺的一种物质。由图7可知，产孢量随着KH2PO4质量浓度的增加而增加，当KH2PO4浓度为1.5 g/l时单孢产孢量达到最大，为7.17×106个孢子，继续增加KH2PO4浓度产孢开始下降，因此选择KH2PO4的最适质量浓度为1.5 g/l。

2.2.4 硫酸镁对孢子增殖的影响（见图8）

图8 MgSO4对孢子增殖的影响

由图8可知，当MgSO4浓度为1.0 g/l时，单孢产孢量达到最高，为5.87×106个孢子，但随着其浓度的继续升高，产孢量下降且幅度较大。因此本试验选取1.0 g/l为MgSO4最适质量浓度。

2.2.5 正交试验

用 L9(34)正交试验筛选出 KH2PO4、MgSO4、MnCl2、和ZnSO4的最佳配比，结果见表1。

由表1可知，在KH2PO4、MgSO4、MnCl2和ZnSO4这4种培养基组分的不同配比中，孢子增殖最多的组合为：KH2PO41.5 g/l、MgSO41.0 g/l、MnCl23.0 mg/l、ZnSO415.0 mg/l。极差分析结果表明，4个因素的影响程度依次为：KH2PO4＞MgSO4＞ZnSO4＞MnCl2。由于理论上优化得到的培养基不在正交试验表中，经验证试验结果表明，黑曲霉单孢产孢量达到7.38×106个，此孢子数大于正交试验中出现的所有数值，验证了选取该结果的正确性。由此确定黑曲霉孢子增殖培养基中无机盐的配比为：KH2PO41.5 g/l、MgSO41.0 g/l、MnCl23.0 mg/l、ZnSO415.0 mg/l。

3 结论

长期以来，β-葡聚糖的抗营养特性已为人们所熟悉，大麦中含有较高水平的混合键连接的β-葡聚糖多聚体,是造成家禽大麦营养吸收低下的原因。β-葡聚糖酶被广泛应用在饲料工业中，对提高家畜的生产性能具有重要作用[9]。黑曲霉产孢量及其产孢速度对实现自动化大规模工业化生产β-葡聚糖酶有重要的影响。本试验是以产孢量为主要评价标准，对固态培养黑曲霉孢子的培养条件及培养基进行优化，分别研究了碳源、氮源、金属离子以及磷酸盐对黑曲霉产孢的影响，通过正交试验进一步分析，确定最适培养条件：培养基体积150 ml/500 ml，接种量103个/瓶；最适培养基：葡萄糖 40.0 g/l、（NH4)2SO43.0 g/l、KH2PO41.5 g/l、MgSO41.0 g/l、MnCl23.0 mg/l、ZnSO415 mg/l、30 ℃培养96 h最终得到黑曲霉单孢产孢量为7.38×106个，优化前单孢产孢量为4.102×106个，优化后的产孢量是未优化条件下的1.8倍，培养时间缩短了72 h。