以棉粕水解液为原料制备氨基酸螯合钙的研究

■邱 玲 祝 吕 张欢欢 李雄飞 张剑

（武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430023）

棉粕蛋白经微生物多菌种发酵和低浓度硫酸酸解后，水解液中除含有种类多、品种全的氨基酸外，还含有硫酸、铵盐和色素。为了综合利用水解液，有必要对其深加工。

复合氨基酸螯合钙是一种既补氨基酸又补钙的双重营养制剂，具有稳定性好、适口性优、生物效价高、与维生素无配伍禁忌等优点；同时，还具有吸收快、抗病、抗应激性等特点[1-2]，因此，受到国内外广泛关注。

本文以棉粕蛋白水解液为原料，先用碳酸钙作降酸、降硫处理，随后，通过考察活性炭的5种预处理方法对水解液的脱色效果，优化了棉粕蛋白水解液的脱色条件。经脱色后的水解液继续用碳酸钙中和至pH值3.8，按α-氨基氮与钙2∶1的比例调配，在合适条件螯合。产品经分离纯化，得到复合氨基酸螯合钙纯品。这些工作对指导复合氨基酸螯合钙的生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：棉粕蛋白水解液(由武汉轻工大学生物与制药工程学院高冰教授提供，主要通过食用曲霉、酿酒酵母以及芽孢菌协同发酵[3]，再经低浓度硫酸水解而成)、活性炭（粒状，AR)、硼酸（AR）、氧化镁（AR）、邻苯二甲酸氢钾（AR）、碳酸钙（科密欧试剂，AR）、棉酚对照品（购买于上海信裕生物科技有限公司，纯度≥98%），标准氨基酸（国药试剂，AR），其他试剂均为分析纯。

仪器：日立氨基酸分析仪（L8800)、MDS-6微波消解仪（新仪微波化学科技有限公司）、HPLC（Vari⁃an）、pHS-3C雷磁数字酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、7200可见分光光度计(UNICO仪器有限公司)、DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)、HH-2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、WXL-5马弗炉(鹤壁天弘仪器)、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、BS224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 分析方法

①棉粕水解液中氨基氮和挥发性盐基氮(TVBN)定量按如下方法操作：取一定量水解液，用氢氧化钠溶液中和，再分别按2,4,6-三硝基苯磺酸法[4]和氧化镁水蒸气蒸馏法[5]测定。水解液中的氨基酸按González-Vega J.C等方法[6]定量。经CaCO3处理过的水解液中的氨基氮和挥发性盐基氮，按文献[4-5]直接定量。

②脱色率计算：在410 nm处分别测定经脱色材料处理前后水解液的吸光度，按下式计算脱色率：

D（%）=（A0-A）×100/A0。

式中：D——脱色率（%）；

A0——脱色前水解液的吸光度；

A——脱色后水解液的吸光度。

③复合氨基酸螯合钙样品分析[包括棉酚、还原糖、挥发性盐基氮（TVBN）、Ca2+、Cl-、SO42-等成分分析]

将样品用盐酸溶解后，溶解物中的棉酚含量按文献[7]定量；还原糖测定按DNS试剂法[8]；挥发性盐基氮按氧化镁水蒸气蒸馏法定量。复合氨基酸螯合钙样品中Ca2+、SO42-、Cl-分析需将样品先消化，再定量。

消化操作如下：取样品0.2 g，置于消解罐，分别加入5 ml浓硝酸和4 ml 30%H2O2，按表1设置微波消解仪参数，开始消化。样品消化好后，用超纯水定容至 100 ml。取样 10 ml，用于分析 Ca2+、SO42-、Cl-含量。钙含量测定采用络合滴定法；硫酸根定量采用重量法；氯离子测定采用莫尔法。

表1 消解样品时微波消解仪设置的参数

2 结果与讨论

2.1 棉粕水解液成分分析（见表2～表3）

表2 棉粕水解液主要成分

表3 棉粕水解液中氨基酸组成与分布(mg/100 ml)

由表2和表3可知，棉粕水解液除含有18种氨基酸外，还含有大量的氢离子、硫酸根离子、挥发性盐基氮等副产物。为综合利用水解液，有必要将副产物除去。为了实现上述目标，棉粕水解液需首先经降酸、降硫处理。

2.2 棉粕水解液的初步降酸、降硫（见表4）

表4 中和至pH值2.0时的棉粕水解液参数

表4给出了棉粕水解液经CaCO3中和至pH值2.0的有关参数。经CaCO3中和至pH值2.0后，水解液中氨基氮损失小。经初步降酸与降硫后，可讨论对水解液的脱色处理。

2.3 活性炭预处理方法对水解液脱色效果

活性炭的预处理：取过40目筛的活性炭5份，每份重5 g。分别用30 ml蒸馏水、2 mol/l硝酸、2 mol/l硫酸、2 mol/l氢氧化钠、饱和Ca(OH)2溶液浸泡24 h。抽滤后，用蒸馏水将活性炭洗至中性，再用滤纸压干，于70℃通风干燥箱中干燥至恒重，以考察它们对中和至pH值2.0的棉粕水解液的脱色效果。

取pH值2.0的水解液6份，每份30 ml。分别用2.5 g预处理过的活性炭处理，处理条件为：70℃下以200 r/min搅拌20 min。经处理后的水解液有关参数见表5。

表5 预处理活性炭方法对水解液脱色的影响

经NaOH处理过的活性炭脱色效果最佳，脱色率达23%，H2SO4次之，Ca(OH)2再次之，HNO3的脱色效果最差。就氨基酸回收率而言，经H2SO4处理过的活性炭，α-氨基氮回收率高达96%，经蒸馏水浸泡处理的回收率最低。这是因为活性炭经H2SO4处理时吸附了部分磺酸基，它们能与色素形成氢键。而在酸性环境条件下氨基酸带正电荷，难与磺酸基结合，故损失少。可见，用H2SO4预处理活性炭为最佳选择。

2.4 水解液脱色条件优化

为了进一步优化硫酸预处理活性炭的脱色条件，分别考察了处理活性炭硫酸浓度、活性炭用量、热处理温度、时间以及水解液初始酸度5个单因素。

2.4.1 预处理活性炭硫酸浓度

取经不同浓度硫酸预处理过的活性炭（干重）2.5 g，对pH值2.0的棉粕水解液于70℃搅拌下处理20 min。经处理后的水解液有关参数见表6。

表6 经硫酸预处理过的活性炭对水解液的处理

由表6可知，当预处理活性炭硫酸浓度从1.0 mol/l增加到2.0 mol/l时，脱色率由11%增加到22%，继续增加硫酸浓度，对脱色的贡献不大。这是因为硫酸浓度为2.0 mol/l时，活性炭吸附的磺酸基趋于饱和，所以，对吸附色素量也趋于一个饱和值。活性炭预处理所用硫酸浓度对α-氨基氮的回收率影响不大，这是因为在酸性条件下负载在活性炭上的磺酸基难以与氨基酸结合。由此可见，预处理活性炭所用H2SO4浓度以2.0 mol/l为宜。

2.4.2 预处理活性炭用量

固定热处理温度和时间分别为70℃、20 min不变，预处理活性炭用量对pH值2.0的棉粕水解液的处理结果见表7。

表7 活性炭用量对水解液的处理结果

预处理活性炭的用量对α-氨基氮的回收率影响不大，但影响脱色效果。当改性活性炭用量从1.0 g增加到2.5 g时，脱色率从5%增加到22%，继续增加活性炭不改变脱色效果。所以，预处理活性炭用量选2.5 g为宜。

2.4.3 处理时间

处理时间对脱色效果的影响见表8。

表8 处理时间对脱色效果的影响（%）

当处理时间低于20 min，脱色率低，这是因为在短的接触时间内不可能实现活性炭对色素的完全吸附。在20～40 min内，脱色效果最好，活性炭对色素的吸附量趋于饱和。当处理时间大于40 min时，脱色效果反而降低，这是因为在高温下处理时间过长会加剧氨基酸的缩合，使色度加深。为此，对棉粕水解液处理的时间定为20 min为宜。

2.4.4 水解液初始酸度

固定待处理水解液量（30 ml）、改性活性炭用量（2.5 g）、处理温度（70℃）和时间（20 min）等参数不变，考察了水解液初始酸度对脱色的影响（见表9）。

表9 棉粕水解液初始酸度对脱色的影响

就脱色率而言，pH值2.0的处理效果最佳，其次是pH值1.0，再次是pH值3.0，pH值7.0的处理效果最差。就氨基氮的回收率而言，pH值2.0时回收率高达96%，pH值1.0的处理效果与pH值2.0接近，其他酸度条件下α-氨基氮的回收率较低。这是因为在酸性条件下水解液中的色素能被附着在活性炭上的磺酸基有效吸附，而氨基酸带正电荷，难与磺酸基形成氢键。在中性或弱酸性条件下，磺酸基对色素的吸附能力弱；而氨基酸大多呈电中性，以氢键的形式被附着在活性炭上的磺酸基吸附。随着酸性减弱，挥发性盐基氮（TVBN）由NH4+逐步转化为NH3，与磺酸基结合成盐，导致经处理后的水解液中挥发性盐基氮有一个快速下降。因此，为了保证高脱色率和高氨基氮回收率，水解液初始酸度选pH值2.0。

2.4.5 处理温度

保持其他条件不变，温度对棉粕蛋白水解液处理的影响见表10。当处理温度从30℃升至70℃时，脱色率由11%增加到22%，但温度高于70℃时，脱色率反而下降。这是因为在低温条件下活性炭对色素的吸附速率慢；而高温会加剧氨基酸缩合，使水解液色泽加深。温度对氨基氮回收率影响趋势与脱色率一致，但温度对挥发性盐基氮的影响甚微。由此可知，在70℃处理水解液，可获得最佳脱色效果和高氨基酸回收率。

表10 温度对棉粕水解液的处理效果

2.5 对水解液作进一步降酸、降硫处理

为了进一步降低水解液总酸度和硫酸根含量，向90 ml的上述处理液中继续添加碳酸钙，调水解液酸度至pH值3.8。滤去沉淀后，得滤液42 ml。此时，滤液的主要成分见表11。与表1相比，棉粕水解液的总酸度、硫酸根大幅下降，α-氨基氮回收率高，但滤液中仍含有大量的挥发性盐基氮（NH4+）、硫酸根，需作进一步处理。

表11 棉粕水解液（pH值3.8）的主要成分

2.6 复合氨基酸螯合钙的制备

参照文献[9]描述的复合氨基酸螯合钙的优化制备方法，略作改动。取pH值3.8的棉粕水解液40 ml，用NaOH调pH值至8.0，按Ca与α-氨基氮的摩尔比1∶2缓慢添加CaCl2，于50℃以200 r/min搅拌30 min，完成钙与复合氨基酸螯合。

复合氨基酸螯合钙的精制：将上述螯合物于4 000 r/min离心15 min。弃去上清液，固形物用40 ml无水乙醇浸泡24 h，以除去还原糖和未螯合的钙离子等杂质（因为还原糖在乙醇中溶解度大，而氯化钙能与乙醇形成配合物）。过滤后，沉淀物经2 mol/l盐酸溶解，滤去不溶物，滤液再用氢氧化钠调pH值至8.0。

重复上述操作，直至沉淀物完全溶于2 mol/l盐酸。随后，用氢氧化钠调pH值8.0。离心分离出沉淀后，固形物再用无水乙醇洗涤至无氯离子检出。取出固形物，将其置于50℃通风干燥箱中风干30 min，称重，得浅米黄色产品0.828 5 g。

样品分析：取0.200 0 g样品，经盐酸溶解后，定容至100 ml。取样分析棉酚、还原糖、挥发性盐基氮（NH4+）含量。结果表明，上述未见检出。

另取0.200 0 g样品，经浓硝酸和30%H2O2消化后，定容至100 ml。分别测定样品中SO42-、Cl-、Ca2+含量。经分析未见SO42-、Cl-检出，钙含量0.027 5 g（6.868×10-4mol），占13.7%。另外，由表3列出的棉粕水解液中氨基酸组成与含量，可求出棉粕水解液中复合氨基酸的平均分子量为128.5 g/mol。设经处理后的水解液中的复合氨基酸的平均分子量维持不变，可推算出螯合物中复合氨基酸的物质的量为1.343×10-3mol，是Ca2+物质的量1.96倍。可见，Ca2+与氨基酸的螯合比为1∶2，经上述工艺制备出的复合氨基酸螯合钙纯度非常高，可以作为饲料添加剂使用。

3 结论

棉粕水解液经CaCO3中和至pH值2.0后，再用经2.0 mol/l H2SO4预处理24 h的活性炭脱色。脱色后的水解液用CaCO3继续中和至pH值3.8，按Ca与α-氨基氮摩尔比0.5补加Ca2+，于pH值8.0和50℃条件下以200 r/min搅拌30 min，完成钙与复合氨基酸螯合。经分离纯化后，含Ca2+量13.7%，Ca2+与α-氨基氮螯合比1∶2，产品不含棉酚等副产物。