肉鸭消化道酵母益生菌的分离与鉴定

■张 霞 王学东 李 彪 彭思源 龚阿琼胡先勤 郑红生

（1.武汉轻工大学，湖北武汉 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武汉市永生鸭业有限公司，湖北武汉 430077）

“鸭脖”是武汉的一张名片。但当前为了得到更好的经济效益，养殖户“购一批鸭，拉一车药”的现象令消费者“恐惧”。药物的滥用，导致病源微生物耐药性(drug resistance)不断增加，而养殖户往往又通过加大用药量或使用高效力药品加以应对，最终导致恶性循环。研究发现，从生物防控角度，利用“以菌（益生菌）治菌（致病菌）”的原理预防疾病，可减少各养殖环节的用药。

国内外均在积极寻找抗生素代替品，其中活性益生菌(probiotics)是最具前途的安全生物制剂之一。而酵母菌(saccharomyces cerevisiae)作为益生菌已被许多国家和地区允许用于动物养殖。酵母菌是一种典型的兼性厌氧型真菌，能够调节胃肠道功能，抑制病原菌。且酵母在胃肠道内能保持代谢活性，向肠道分泌多种营养代谢产物，如蛋白质、脂肪、糖及B族维生素等，也可以促进小肠吸收氨基酸[1]。酵母细胞壁内层含葡聚糖，这些大分子能激发非特异性和特异性免疫反应，激活T细胞、B细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞[2]。同时酵母菌有耐受细菌类抗生素作用。理想的益生菌菌株最好来自于肠道。

本研究旨在从肉鸭消化道内分离筛选出酵母益生菌，通过26S rDNA分子方法、形态学和生理生化试验等鉴定酵母菌的种属，为开发高抗性、专一型的酵母益生菌制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

从宜昌肉鸭场、农贸市场（武汉江夏区）、散养农户（武汉水边散养）、武汉肉鸭场4个地方分别选取生长良好、健康、表现及精神状态好的6只肉鸭(共计24只)。

1.1.2 培养基

麦芽汁培养基、高氏（Gorodkowa）琼脂培养基、YPD培养基、马铃薯琼脂培养基、糖发酵基础培养基、同化碳源基础培养基、同化氮源基础培养基、类淀粉化合物液体培养基、无维生素基础培养基、尿素分解培养基、无机盐葡萄糖培养基、高渗透压培养基。

糖发酵培养基：D-葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖。

同化碳源培养基：乙醇、麦芽糖、纤维二糖、水杨苷、DL-乳酸、D-阿拉伯糖、棉子糖。

同化氮源培养基：硝酸钾、L-赖氨酸、尸胺。

无维生素培养基：分别为不含有烟酸、吡哆醇、硫胺素的基础培养基。

以上培养基均为国产的化学纯或者分析纯试剂。

1.1.3 试剂

山梨醇（Biosharp）、酵母基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech）、Lyticase（Tiangen Biotech）、琼脂糖、吕氏碱性美兰染色、克酚红等均为国产。

1.1.4 仪器设备

单人单面净化工作台（SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司）、恒温恒湿培养箱（LRHS-150-Ⅱ，上海跃进医疗器械有限公司）、电泳仪（DYY-8C，北京市六一仪器厂）、PCR仪（TC-XP，BIO-RAD）、凝胶成像仪（Gel DocTMEZ，BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 肉鸭消化道酵母菌的采集与保存

按照解剖学位置，依次从肉鸭的腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠6个部位提取消化道内容物，装入封口袋后4℃保存。

1.2.2 酵母菌的分离纯化

取6个部位消化道样品用平板稀释法在麦芽汁琼脂平板上于28℃条件下培养2 d，挑取单菌落进一步用平板划线法纯化2～3次。之后挑取少量纯化后的菌体接种于YPD琼脂斜面上，于28℃恒温培养箱中培养2～3 d，然后将其放入4℃冰箱中保存备用[3]。

1.2.3 酵母菌的26S rDNA序列分析[4]

1.2.3.1 酵母基因组DNA提取

用酵母基因组DNA提取试剂盒进行26S rDNA的提取。

1.2.3.2 酵母菌26S rDNA片段扩增和测序

用于26S rDNA PCR反应引物：

上游引物 NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAG⁃GAAAAG-3'；

下游引物NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

PCR反应体系为50 μl，每管加入10× Taq Buffer 5 μl；20 μmol/l上下游引物各1 μl，2.5 mol/l dNTP 4 μl，模板 DNA 10 μl，5.0 U/μl Taq 0.5 μl。

反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s；55℃退火60 s；72℃延伸70 s，共进行30个PCR循环，最后再72℃继续延伸10 min，4℃保藏。

测序：将纯化后的PCR产物送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，所得到的序列与Genbank数据库的基因序列进行同源性比较。

1.2.4 酵母菌的生理生化鉴定

1.2.4.1 酵母菌的形态学鉴定

依据田辉艳等[5]的方法进行菌落特征观察、细胞形态观察、掷孢子的形成观察、菌丝形成观察和子囊孢子的形成观察试验。

1.2.4.2 酵母菌的生理生化鉴定[5-7]

采用糖发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验、类淀粉化合物形成试验、抗放线菌酮试验、无维生素生长试验、尿素水解试验和耐高渗透压试验进行酵母菌种属的鉴定。

2 结果

2.1 肉鸭消化道酵母菌分离结果

不同地区肉鸭的消化道各个部位分离的酵母菌见表1。可见从宜昌肉鸭场肉鸭消化道6个部位分离出10株酵母菌；农贸市场肉鸭消化道6个部位分离出6株酵母菌；散养农户肉鸭消化道6个部位分离出12株酵母菌；武汉肉鸭场肉鸭消化道6个部位分离出7株酵母菌。本次总共分离得到了35株酵母菌。

2.2 酵母菌26S rDNA分子鉴定结果

2.2.1 酵母菌26S rDNA PCR扩增电泳结果

用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌株的26S rDNA，使用引物NL1、NL4对酵母菌株进行26S rDNA的PCR扩增，结果见图1～图4。从图中可以看出，扩增所得的产物大多在500～600 bp之间。

表1 不同地域肉鸭消化道酵母菌分布情况(株)

图1 宜昌养殖场肉鸭消化道酵母菌26S rDNA扩增电泳图谱

图2 农贸市场肉鸭消化道酵母菌26S rDNA扩增电泳图谱

图3 散养农户肉鸭消化道酵母菌26S rDNA扩增电泳图谱

图4 武汉养殖场肉鸭消化道酵母菌26S rDNA扩增电泳图谱

2.2.2 肉鸭各肠段的酵母菌株26S rDNA序列测序结果分析

将测序所得基因序列利用NCBI数据库Blast软件进行基因序列同源性分析，结果见表2～表5。

表2显示，从宜昌肉鸭场6只肉鸭消化道分离的10株酵母菌中，Candida albicans6株、Cryptococcus arboriformis1株、Kazachstania bovina2株、Candida parapsilosis1株。

表3显示，从农贸市场的6只肉鸭消化道分离的6株酵母菌中，Candida albicans2株、Candida parapsilo⁃sis2株、Lodderomyces elongisporus1株、Kodamaea ohmeri1株。

表4显示，从散养农户的6只肉鸭消化道分离的12株酵母菌中，Candida albicans1株、Cryptococcus arboriformis1株、Kazachstania bovina2株、Candida parapsilosis4株、Saccharomyces cerevisiae4株。

表5显示，从武汉肉鸭场6只肉鸭消化道分离的7株酵母菌中，Candida glabrata2株、Candida albicans1株、Saccharomyces cerevisiae3株，Lodderomyces elongispo⁃rus1株。

表2 宜昌肉鸭场肉鸭消化道酵母菌26S rDNA测序结果分析

表3 农贸市场肉鸭消化道酵母菌26S rDNA测序结果分析

表4 散养农户肉鸭消化道酵母菌26S rDNA测序结果分析

表5 武汉肉鸭场肉鸭消化道酵母菌26S rDNA测序结果分析

综合表2～表5可知，分离出的35株酵母菌长度在500～650 bp之间，与模式菌株的基因序列同源性都在99%或100%。其中Candida albicans10株、Crypto⁃coccus arboriformis2株、Kazachstania bovina4株、Candida parapsilosis7株、Lodderomyces elongisporus2株、Kodamaea ohmeri 1株、Candida glabrata2株、Sac⁃charomyces cerevisiae7株。

由于目前的饲用酵母菌株中，只有酿酒酵母属（Saccharomyces cerevisiae）是可以安全使用的，所以将分离的7株酿酒酵母编号为Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7进行进一步的鉴定。

2.2.3 酿酒酵母菌株菌落形态及生理生化鉴定结果（见表6、表7）

由表6可知，Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7菌株菌落都为乳白色，菌株大多为圆形或卵圆形，其无性繁殖方式为出芽生殖；Y-2、Y-4、Y-6、Y-7菌株均有假菌丝，都不产生掷孢子；子囊内有1～2个光滑的圆形或卵圆形子囊孢子。

表6 7株酿酒酵母的形态学特征

表7 7株酿酒酵母的生理生化试验结果

从表7可知，7株菌都能发酵D-葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，都不能发酵乳糖。只有Y-4不能发酵半乳糖，其他菌株都能发酵，而Y-2和Y-6不能发酵蜜二糖，其他菌株都能发酵。碳源同化实验中都不能同化纤维二糖、水杨苷、D-阿拉伯糖、木糖醇、柠檬酸盐和甲醇，Y-4不能同化乙醇，能同化蔗糖，其他菌株相反；只有Y-3菌株能同化D-半乳糖，其他菌株不能，麦芽糖、DL-乳酸、棉子糖都是有些菌株可以同化，有些不能同化。氮源同化试验中，7株菌都不能同化硝酸钾、L-赖氨酸、尸胺。无维生素试验生长试验中，无烟酸试验都显阳性，无吡哆醇试验中Y-2、Y-3、Y-6显阳性，其他几株菌显阴性；无硫胺素试验则是Y-2、Y-4、Y-5显阳性，其他显阴性。另外，在0.01%放线菌酮试验、类淀粉化合物形成试验、尿素分解试验和50%D-葡萄糖生长试验中，7株菌都显阴性。

根据《Yeasts Characteristies and Identification》[8]中所提供的检索方法来进行生理生化鉴定，其形态学、生理生化特性符合酿酒酵母属特性。

3 讨论

酵母益生菌是重要的饲用益生菌之一，其耐受肠道pH值变化，能调节肠道环境微生态平衡，提高动物机体免疫能力。一般认为，理想的益生菌菌株最佳来源为原籍动物肠道。国内关于肠道酵母益生菌的分离、鉴定的研究较少。魏亚松等[9]从水貂肠道分离出了2株酵母菌；胡秀彩等[10]和吕爱军等[11]都从斑马鱼肠道中分离出酵母菌；张可毅等[12]将鸡肠道分离的一株假丝酵母经批量培养后饲喂肉鸡，对肉鸡生长具有促进作用；田辉艳等[5]、周平[3]等分离了猪肠道酵母菌。而对肉鸭肠道酵母益生菌的分离、鉴定研究未见报道。本研究从4个不同地域采集健康成年肉鸭消化道6个肠段（胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠)内容物分离酵母菌，共分离出了35株酵母菌。

经常能从宿主体内分离到的菌株，而且数目较多，被称为常住菌，又叫原籍菌群。反之，不能经常从机体分离出来的菌株为过路菌。本研究从4个不同地域肉鸭消化道采集的样品，胃中虽都分离出了酵母菌，但是数量很少，其他消化道如十二指肠只有从散养农户肉鸭消化道采集的样品分离出了酵母菌，回肠从宜昌肉鸭场、农贸市场、散养农户肉鸭消化道采集的样品都分离出酵母菌，但从武汉肉鸭场采集的样品未分离出酵母菌，结肠只有从宜昌肉鸭场肉鸭消化道采集的样品才分离出酵母菌，其他几个地域采集的样品都未分离出酵母菌，且数量都很少，证明酵母菌能耐受肉鸭消化道环境，但是在消化道中为过路菌。

Kurztman等[13-14]测定了所有已知酵母种类的26S rDNA的D1/D2区域序列，发现这段区域序列变异性较高，且同一菌种在这个区域替代率一般不大于1%，而不同种的菌株差异更大，由此可以将绝大部分种区分开。赵丽丽等[15]从葡萄、苹果等样品中分离出的18株酵母进行26S rDNA D1/D2区域碱基序列分析，与基因库中的基因序列进行比对，同源性99%或100%，说明此方法可以实现酵母菌种级水平鉴定。杨艳艳等[16]从工业污水处理池中分离耐碱酵母菌，通过26S rDNA 5’端D1/D2区基因序列分析，同源性为99.8%。

本试验对分离的酵母菌进行26Sr DNA的D1/D2区段基因序列测定，与Genbank数据库基因序列进行比对，同源性均在99%或100%。分离出的35株酵母菌分别为Candida albicans10株、Cryptococcus arbori⁃formis2株、Kazachstania bovina4株、Candida parapsi⁃losis7株、Lodderomyces elongisporus2株、Kodamaea ohmeri1株、Candida glabrata2株、Saccharomyces cerevisiae7株。对7株酿酒酵母进行形态学和生理生化试验，进一步验证26S rDNA的分析结果。根据农业部《饲料添加剂品种目录（2013）》征求意见稿中所列酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是属于允许添加的饲用微生物。

4 结论

从4个不同地域的肉鸭消化道的6个部位共分离出35株酵母菌，其中有7株为酿酒酵母菌，这些菌株可作为肉鸭专用饲用酵母益生菌的备选菌株。