抗菌肽的免疫调节功能及其作用机制

■卫旭彪 武如娟 郑召君 廖秀冬 张日俊

（中国农业大学饲料生物技术实验室动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

抗菌肽广泛存在于从细菌到哺乳动物的生物中，按其来源不同可以分为细菌抗菌肽、植物抗菌肽、昆虫抗菌肽、两栖动物抗菌肽等。抗菌肽因其分子量小、抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特等多重优势已成为动物和人类医学、营养学、饲料（食品）学和免疫学等领域的研究热点。研究发现，许多抗菌肽不但可以直接抑制细菌、真菌、寄生虫以及病毒的生长，而且在先天性免疫反应中发挥着重要作用。最新证据表明，抗菌肽可以作为有效的辅助物，协同其它免疫因子，强化适应性反应和促进伤口愈合。因此，随着抗菌肽作用机制的不断阐明，将其作为药物应用于人类和畜禽疾病治疗的想法将有可能逐步实现。

1 抗菌肽在宿主防御中的作用

抗菌肽家族的成员广泛地分布在自然界中，是双亲性的阳离子肽。它们一般被定义为：具有大约12～60个氨基酸，其中包含2～7个带有正电荷氨基酸残基并且其中疏水氨基酸占有一定比例。它们折叠成不同的二级结构（通常在插入膜双分子层后）并带上电荷和极性，然后疏水的残基覆盖在分子的表面。早期对细菌、真菌以及病毒的研究已经表明，这些抗菌肽对不同的微生物有直接的抗菌作用。最近，有学者又发现，抗菌肽对免疫调节具有多种作用，而这种免疫调节对宿主感染细菌和炎症的产生有重要影响。

1.1 抗菌肽与免疫因子共表达

先天性免疫是最古老的免疫防御方式，它对于脊椎动物和无脊椎动物的宿主防御都很重要。近期发现的多种免疫因子（尤其是TLRs，Toll-like receptors）在先天免疫系统中呈现出前所未有的复杂性和多样性。这些活性很强的免疫因子，在序列和结构上具有很大的差异，但不论在脊椎动物还是无脊椎动物中都有着相似的作用。它们广泛分布在免疫系统的细胞（如白细胞、帕内塔细胞）和被细菌感染的组织（如肠道、呼吸道）中。观察发现，这些因子在炎症引起的表达和分泌中是必要的。

成熟（具有生物活性）肽的表达与物种、组织类型、细胞家系及分化水平有关。基因的表达和蛋白的分泌由许多因素诱导，比如细菌产物、损伤或炎症刺激。例如，当单核细胞接触细菌、脂多糖（LPS）或者干扰素-γ（IFN-γ）时，人类β防御素（hBD-1和hBD-2）的表达会升高；当角化细胞受到肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β)、细菌或白细胞介素-22（IL-22）等的刺激时，hBD-2和hBD-3的表达会升高；而当肠道、子宫和呼吸道上皮细胞被TLR兴奋剂刺激时，hBD-1、hBD-2和hBD-3的表达会升高。抗菌肽编码序列的5’端上游有多个潜在一致的序列提供给转录因子，包括核因子（NF）κB、白细胞介素-6核表达因子（NF-IL6）、急性期反应因子和IFN-γ反应因子。单核细胞中hBD-2的合成是由IL-1β诱导，而在肠上皮细胞中是由LPS和肽聚糖诱导，这取决于NFκB。但是在角化细胞中，由IL-22诱导的hBD-2和hBD-3的表达取决于转录激活因子STAT3。IL-1、TNF-α和TLR等激活剂也可以激活NFκB。哺乳动物中的转录因子负责多重发炎和免疫基因的转录。这些信息表明，抗菌肽的转录调节取决于刺激物和细胞的类型，并且受到先天免疫和急性炎症中其它物质表达的调节。

1.2 抗菌肽对细菌感染的防御作用

在人和小鼠体内的试验表明，抗菌肽在免疫中扮演一定的角色。它的表达与机体抵抗细菌感染的敏感度密切相关。具有特异性抗体缺乏症的患者往往会缺乏α-防御素并且遭受严重且频繁的细菌感染。另外一些患有柯士文症的人频繁遭受口腔细菌感染和严重的牙周炎，这与人类抗菌肽LL-37和α-防御素的缺乏有关。LL-37、hBD-2和hBD-3的低水平表达会导致皮肤对细菌感染的敏感性增强，进而引发皮肤炎损伤皮肤。相反，当患有牛皮癣和支气管肺泡炎症时，hBD-2和hBD-3的表达会相应增强。在皮肤角化细胞中，抗菌肽[LL-37和小鼠体内与人源性抗菌肽cathelicidin相关的抗菌肽（CRAMP）]的表达随着感染和损害的不同而不同。

当啮齿动物遭到细菌侵染后，抗菌肽可以通过控制细菌的数量来降低其死亡率。β防御素-1和CRAMP基因消除的小鼠更易于遭受细菌感染，且也更难于消除。需要指出的是，尽管这些发现一致表明抗菌肽在宿主防御中扮演着重要角色，但是到底它们是直接杀灭细菌还是起一个免疫调节作用或者二者兼有，尚没有明确区分。此外，这些发现表明，抗菌肽和防御素的表达与机体被细菌感染和发生炎症的状态有关。同时也说明了抗菌肽在先天防御、清除、阻止和防御细菌攻击方面具有重要作用。

2 直接的抑菌作用

体外试验发现，抗菌肽对机体的保护作用一部分要归功于大多数抗菌肽能够与细菌的细胞膜结合。通过对细胞膜双分子层进行大量局部的作用，会形成许多离子渗透通道，进而提高了细胞的通透性，最终导致细菌死亡。相反，包括美洲鲎素（一种非常有效的马蹄蟹抗菌肽）在内的许多抗菌肽则能够直接跨过细胞膜，与细胞内的一个或多个阴离子靶标作用最终杀死细菌。实际上，只要在体外适宜的环境下，所有的人源性抗菌肽和防御素均有直接的抗菌作用。许多抗菌肽在体外的模拟生理环境下可以保持杀菌能力，但这经常会被生理盐环境和单价或多价的离子和血清所破坏。毫无疑问，许多抗菌肽（例如在嗜中性粒细胞中的α-防御素）需要维持在一个可以保证它们正常发挥功能的浓度；然而，低的杀菌浓度和与生理盐的拮抗作用（例如在黏膜上皮细胞中）一致说明了一些抗菌肽在体内还存在着其它的作用方式。

3 免疫系统调节因子

最新发现表明，在先天性免疫细胞（如嗜中性粒细胞和上皮细胞）和连接先天性免疫系统和适应性免疫系统的细胞内（如单核细胞、巨红细胞和树突细胞（dendritic cells，DCs）），当处于肽、盐和血清的生理浓度下，抗菌肽可以产生一系列的生物学效应（炎症反应、先天免疫和适应性免疫）。哺乳动物宿主防御肽已经被证实可以促进、抑制或者补充某些细胞功能，比如趋药性、细胞凋亡、基因转录和细胞激素的产生。尽管这些生物作用不是直接杀灭细菌，但是这些生物作用可能也促进细菌的清除。另外，这些证据表明抗菌肽除了直接杀菌以外还有其它的免疫功能，比如可以抑制一些细菌诱导的细胞激素的产生（抗发炎）、促进伤口愈合、增快血管生成和充当辅助剂，这些都已经在动物和组织模型中得到证明。

4 免疫激活

在感染部位和受伤部位分泌的抗菌肽和抑制素对于效应细胞具有趋化作用，同时也会诱导趋化因子的转录和分泌，促进了先天性免疫和适应性免疫细胞的密集，促进肥大细胞分泌组胺。同时，这也补充了先天性免疫和适应性免疫中对病菌的体液免疫和细胞免疫的作用。α-防御素、hBD-2、hBD-3和hBD-4是单核细胞、（记忆和初始）T细胞及未成熟的DCs的趋化因子。牛、人、鼠和猪的抗菌肽对几乎所有的体内和体外外周的红细胞具有趋化作用。例如，LL-37可以诱导IL-8的释放，而IL-8又可反过来促进中性粒细胞的趋化性和高浓度LL-37的释放。在无脊椎动物体内也发现了类似的情况。通过趋化作用，循环血细胞移动到受伤的部位，并在那里释放抗菌肽。抗菌肽还可以刺激某些细胞激素的释放。例如，一种来自鲎的抗脂多糖因子的肽可以诱导人类外周单核血细胞中抗病毒激素和免疫调节细胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-2和IL-13的释放。另外，这种肽可以提高经致命剂量绿脓假单胞菌处理过小鼠的存活率，而绿脓假单胞杆菌与脾脏和肝脏中TNF-α的减少和IL-2、IL-12和IL-13 mRNA合成的增加有关。LL-37不但可以诱导人类角化细胞中IL-6、IL-8、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及IL-1β的释放，而且可以增强产LL-37未成熟的DCs中TNF-α和IL-6的分泌。小鼠β-抑制素-2的成熟DCs也分泌促炎的[辅助性T细胞1（Th1）极化]细胞激素IL-12、IL-1α和IL-6。

5 炎症和免疫的抑制

尽管哺乳动物抗菌肽可以直接刺激一些先天免疫作用，被认为是促炎（如白细胞的趋化反应和细胞激素、趋化因子及组胺的诱导释放）。但是，它们同时能够保护宿主免受有害的、潜在的致命因子的作用，尤其是由过量的TLR诱导产生的炎症反应。抗菌肽不但可以抑制促炎激素（如TNF-α和IL-6）基因的转录以及由脂多糖和其它细菌产物诱导的促炎传递因子的释放，还可以阻止啮齿动物在遭受细菌感染后败血症的发生。抗菌肽中和细胞内毒素的行为也揭示了其可维持体内稳态，尤其是在富含共生体的肠区域和阻止过度炎症反应的发生。此外，它会阻止那些引发强烈组织损伤和炎症的有毒成分的释放（例如，富含脯氨酸-精氨酸的猪抗菌肽PR-39可以抑制活性氧的产生；而牛骨髓抗菌肽-28促进被感染的淋巴细胞的凋亡），并且有效促进组织再生。总之，人源抗菌肽促进细胞增殖、分裂和受伤修复。抗菌肽的这种中和和调节作用使宿主免遭炎症反应中有害成分的破坏。

6 增强免疫

许多迹象表明，抗菌肽可以将先天性免疫和适应性免疫连接起来，调节DC的功能和特异的抗原免疫反应。LL-37可以诱导以单细胞为主要来源的DCs分化，增强其内吞能力，调节具有吞噬作用的受体的表达和功能的发挥，提高协同刺激分子的表达（CD86），并增加通过LPS刺激DCs而产生的Th1细胞激素的分泌。同样地，小鼠BD2刺激DC的成熟和协同刺激分子（CD40、CD80和CD86）、主要的组织相容性复合体系列Ⅱ和趋化因子受体CCR7（CCR7可以控制与富含T细胞的区域之间的交流）的表达。通过这种方式，抗菌肽也许可以增强适应性免疫的许多方面，促进某些细胞系的分化，改变细胞激素环境。这反过来强化了这种反应。IL-22提高了角化细胞中hBD-2和hBD-3的表达，增加了Th2细胞中IL-4的释放，促进了主要组织相容性复合体Ⅰ抗原和急性期蛋白的表达。过敏性皮肤炎患者皮肤中hBD-2和hBD-3 mRNA的低水平表达与Th2细胞激素表达的提升有关。这些信息表明，适应性免疫的一些方面与宿主抗菌肽的表达和潜在功能与适应性免疫密切相关。另外，LL-37可以和一些细胞激素协同发挥作用，比如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-1β,这使得低浓度的肽也可以发挥免疫效应。作为辅助剂，LL-37、CRAMP和小鼠BD2可以增强特异性抗原的体液和细胞免疫反应。这些肽可以作为有效的辅助因子发挥各种作用，包括补充、促分化和激活感染部位的效应细胞。然而，迄今为止，这些肽对淋巴细胞功能发挥（B细胞激活和抗体产生、细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞的杀伤作用和辅助细胞的功能）的作用文献中少有报道。

7 免疫调节机制

抗菌肽的生物效应，跟它们的表达和分泌类似，通常是在炎症刺激下产生（包括内源性和致病性来源的微生物保守成分）且受一定生理环境的影响，包括抗菌肽的浓度、胞内环境和胞外可溶解物质成分。抗菌肽的免疫调节作用机制也有许多种，包括直接与内毒素LPS、已知的或假设的细胞表面受体和细胞内信号分子或受体结合。据报道，人源抗菌肽可以和许多受体结合，激活分裂酶原的蛋白激酶通路的成分，促进Ca2+的转移，结合到含SH3位点的蛋白质上并抑制LPS诱导的NFκB的移位。人源抗菌肽的这种受体-配体的相互作用并不是很好理解。抗菌肽的许多功能依赖已知的受体（如LL-37通过甲酰肽类受体直接调节人外周血中性粒细胞、单核细胞和T细胞），但它们的另外一些生物功能与这些已知的受体没有关系。

8 治疗

具有很远进化关系的不同物种的抗菌肽具有类似的功能表明，人类可以通过对脊椎动物和无脊椎动物的研究来设计一个适用于人类的新的抗病原体感染药剂的模板。尽管目前研究尚浅，但是越来越多关于天然和合成的哺乳动物抗菌肽免疫调节作用的报道正不断涌现出来，包括对LPS的中和、对信号转导的引导以及对基因转录和活性氧释放的促进作用。随着应用抗菌肽magainin开发的抗菌肽药品MAI278已经接近完成Ⅲ期临床试验，许多公司都开始急切地想把宿主防御肽变成一种新型的抗菌治疗药物。抗菌肽在不同的物种间有功能性的冗余，具有防腐和抗菌的作用，还具有辅助功能和低毒性，这些特点使它成为一种极具吸引力的治疗药剂。此外，对各种抗菌肽不同活性区域的准确定位（证明具有抗菌和免疫调节作用）也进一步使得研发具有潜在的特异功能的抗菌肽成为可能。

9 结论

总之，新的证据表明抗菌肽积极参与宿主免疫防御的各个阶段，既可以通过直接杀灭方式发挥抗菌作用，也可以在炎症和免疫反应或者控制和消除炎症反应中，通过与联接先天性免疫和适应性免疫的系统细胞间进行交流来刺激免疫效应细胞的生物功能。

更多的一些关于抗菌肽的详细研究将帮助我们更好地理解这些肽是如何识别和中和那些病原体的，这将会帮助我们建立一个新的抗感染的治疗策略。这些研究通过阐明抗菌肽的作用机理，既可以拓展我们目前对抗菌肽结构-功能研究的范围，又可以促进对于抗菌肽免疫调节功能的报道。最重要的是，未来将可在与生理环境有关的条件下开拓和建立关于抗菌肽不同性质的各种研究，并且最终在体内确认抗菌肽的功能，以保护宿主免受细菌的感染并抑制潜在的有害炎症的发生。

（参考文献53篇，刊略，需者可函索）