亳菊和大马牙中绿原酸、黄酮类成分及挥发油含有量的比较

王甫成， 时维静， 龚道锋， 程 磊， 纪东汉

（1.安徽中医药科学院亳州中医药研究所，亳州职业技术学院，安徽 亳州236800；2.安徽科技学院，安徽凤阳233100）

亳菊和大马牙中绿原酸、黄酮类成分及挥发油含有量的比较

王甫成1， 时维静2， 龚道锋1， 程 磊1， 纪东汉1

（1.安徽中医药科学院亳州中医药研究所，亳州职业技术学院，安徽 亳州236800；2.安徽科技学院，安徽凤阳233100）

目的建立HPLC法同时测定亳菊和大马牙中绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素，为选用药用菊花提供参考。方法2种菊花以70%甲醇提取，HPLC分析采用Shim-pack C18柱（4.6 mm×250mm，5μm），流动相为乙腈 （A相）-0.1%磷酸 （B相）梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长348 nm；按 《中国药典》方法测定它们的总挥发油含有量。结果绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素分别在0.5～5.0μg、0.11～1.1μg、0.74～7.4μg、0.39～3.9μg、0.28～2.8μg范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为99.3%（RSD=2.0%）、99.3%（RSD=2.0%）、99.7%（RSD=1.9%）、99.1%（RSD=2.0%）、98.0%（RSD=1.8%）。亳菊挥发油提取率为0.52%，大马牙为0.42%。亳菊中的绿原酸、木犀草苷、槲皮素、金合欢素和总挥发油含有量高于大马牙，但大马牙的黄芩苷含有量高于亳菊4倍多。结论大马牙中绿原酸和木犀草苷含有量未能在线性范围内测得，所以不能代替亳菊入药。

亳菊；大马牙；绿原酸；木犀草苷；黄芩苷；槲皮素；金合欢素；挥发油

菊花（Chrysanthemi Flos）为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium（Ramat.）的干燥头状花序，味甘、苦，微寒；归肺、肝经；具有散风清热，平肝明目，清热解毒之功效；可用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等［1］。《神农本草经》将其列为上品，称 “久服利气血，轻身耐老延年”，是我国传统常用中药材，药食两用，应用广泛。菊花中绿原酸具有明显的抗菌、抗肿瘤和保护心血管的活性［2］；木犀草苷具有降血脂、降压及免疫双向调节等作用［3］；槲皮素具有抗氧化及清除自由基和抗炎、抗菌、抗病毒及心血管保护等作用［4］；金合欢素具有抗AIDS的作用［5］，同时可作用于人的肝癌细胞系的增殖阶段G2，诱导细胞的凋零，促成细胞周期的停滞［6］。木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素都是黄酮类成分，菊花总黄酮具有抑制骨肉瘤细胞增殖及诱导凋亡的作用［7］。

安徽亳州是菊花的重要产区，种植的品种有亳菊、大马牙、小白菊和杭白菊等。小白菊和杭白菊常作为饮品应用，作为药用入药的亳菊近年来资源越来越少，濒临枯竭，究其原因是亳州当地药农因大马牙菊花花大、产量高而弃种亳菊改种大马牙，用大马牙来充当亳菊来用。为引导药农种植正宗亳菊，王德群等［8］从产地调查、栽培观察和标本研究等方面，对亳菊和大马牙2个品种菊花进行了详实比较分析，指明2种菊花是不同品种菊花，在种植和用药过程中不能混淆。本实验采用HPLC法考察亳菊和大马牙中绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素5种成分，并对其总挥发油含有量进行比较，探究亳菊和大马牙2种菊花内在成分及质量的差异，从多成分角度分析大马牙不能简单替代亳菊入药，为药用菊花亳菊质量评价与科学选用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT型分析半制备高效液相色谱仪 （日本岛津公司）、AF240型电子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 绿原酸对照品 （110753-200908）、木犀草苷对照品 （111720-200806）、黄芩苷（110715-201003）、槲 皮 素 对照品 （100081-201005）购自中国药品生物制品检定所，金合欢素对照品由安徽科技学院时维静教授提供。乙腈、磷酸、甲醇均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

实验所用亳菊和大马牙药材采收于安徽省亳州市谯东药用植物园、亳州市魏岗镇菊花种植基地和安徽中医药科学院亳州中医药研究所药用植物园，由安徽科技学院时维静教授鉴定，分别为亳菊Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Boju' cv.nov.、大马牙Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Da maya'cv.nov.的干燥头状花序。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5μm）；以乙腈 （A相）-0.1%磷酸水溶液（B相）梯度洗脱（0～11 min，10%～18%A；11～30 min，18%～20%A；30～40 min，20%～30%A；40～50 min，30%～40%A；50～60 min，40%～42%A；60～65 min，42%A；65～75 min，42%～60%A；75～85 min，60%～70%A）。体积流量1.0 mL/min；检测波长348 nm，柱温30℃；进样量10μL。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的配制 分别取绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解并制成每1 mL含绿原酸2.500 mg、木犀草苷0.550 mg、黄芩苷3.700 mg、槲皮素1.950 mg、金合欢素1.400 mg的对照品贮备液。再精密量取以上对照品贮备液各1 mL置于10 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含绿原酸0.250 0 mg、木犀草苷0.055 0 mg、黄芩苷0.370 0 mg、槲皮素0.195 0 mg、金合欢素0.140 0 mg的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别精密称取亳菊、大马牙2种菊花样品粗粉 （过40目筛）2 g置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 m L，密塞后称定质量，常温下超声提取 （功率300W，频率45 kHz）40 min，放置冷却后再次称定质量，并用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，按 “2.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，结果显示绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素得到很好分离，与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，混合对照品和样品色谱图见图1。

图1 混合对照品 (A)、供试品亳菊 (B)、大马牙 (C) HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of m ixed reference substances(A),Boju sam p les(B),and Da maya sam p les(C)

2.3.2 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液，依次按2、6、8、12、16、20μL分别进样，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，混合对照品进样量 （μg）为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归方程计算。各成分的线性回归方程、线性范围和相关系数见表1。

表1 5种成分的线性关系、回归方程和相关系数Tab.1 Linear ranges and regression equations of five constituen ts

2.3.3 精密度试验 取绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进6次样，分别计算峰面积RSD。结果绿原酸峰面积RSD为1.7% （n=6）、木犀草苷峰面积RSD为1.0%（n=6）、黄芩苷峰面积RSD为1.9%（n=6）、槲皮素峰面积RSD为1.8%（n= 6）和金合欢素峰面积RSD为1.4% （n=6），结果表明精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批亳菊药材样品，共6份，按供试品制备方法制备平行供试品溶液，按上述色谱条件分别进行测定。结果亳菊药材样品中绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素的平均质量分数分别为0.403 0%、0.051 5%、0.212 0%、0.403 0%、0.291 0%，RSD分别为1.9% （n=6）、1.4% （n=6）、1.6% （n=6）、1.7% （n=6）、1.4% （n=6），表明本测定方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取 “2.2.2”项下供试品溶液，分别在0、3、6、8、12、24 h测定，进样量为10μL，分别计算绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素的峰面积RSD。结果绿原酸峰面积RSD为1.4%（n=6）、木犀草苷峰面积RSD为1.1% （n=6）、黄芩苷峰面积RSD为1.5%（n=6）、槲皮素峰面积RSD为1.0% （n=6）和金合欢素峰面积RSD为1.3% （n=6），结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 回收率试验 取已知各成分质量分数 （绿原酸0.402 0%、木犀草苷0.051 0%、黄芩苷0.212 0%、槲皮素0.404 0%、金合欢素0.290 0%）的亳菊药材样品粗粉 （过40目筛）6份，各约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入绿原酸对照品贮备液3.20 m L、木犀草苷对照品贮备液1.90 mL、黄芩苷对照品贮备液1.10 mL、槲皮素对照品贮备液4.20 mL、金合欢素对照品贮备液4.20mL，甲醇补足至50 mL，密塞，称定质量，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下条件进行测定，计算绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素加样平均回收率和RSD，见表2，结果表明，本方法回收率良好。

表2 菊花中5种成分加样回收实验结果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests for five constituents in Ch rysanthem i F los(n=6)

2.4 样品测定 分别取采自亳州3个不同种植地的亳菊和大马牙菊花药材样品各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按 “2.1”项下条件进行HPLC分析测定，分别进样10μL，记录峰面积，采用标准曲线法计算样品中绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素的含有量，结果见表3。

表3 样品的测定结果(n=9)Tab.3 Determ ination resu lts of sam p les(n=9)

2.5 挥发油的测定 分别取采自亳州3个不同种植地的亳菊和大马牙菊花药材样品各50 g，按照《中国药典》2010年版一部附录XD挥发油测定法的甲法操作［1］，测得样品中挥发油的含有量，结果见表4。

表4 挥发油测定结果Tab.4 Results of volatile oil conten t determ ination

3 讨论

参考相关文献［9］，在200～400 nm扫描，发现绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素4种成分在348 nm处有较高的吸收，干扰少且峰好，因此检测波长选取348 nm进行测定。

按照 《中国药典》2010年版菊花项下流动相梯度洗脱，槲皮素、金合欢素峰重叠，分离不开。参考有关文献［10-12］，综合绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素5种成分的结构特点，需要在30 min后进一步细化流动相梯度，才能将槲皮素、金合欢素分开，经变换梯度，反复摸索，获得分离效果最佳的流动相梯度。

亳菊和大马牙两个品种菊花在安徽亳州都有种植，近年来，因亳菊产量不高而大马牙花大、产量高，当地药农追求经济效益弃种亳菊而大量种植大马牙这一品种菊花，导致亳菊药材濒临枯竭，影响到药用菊花临床选用。王德群［8］从花头状花序形状、大小、总包层数，舌状花的颜色、层数、内外层的长度，管状花数量、颜色等方面将亳菊和大马牙两种菊花做了细致比较鉴别，指出了2种菊花品种的差异。对单一菊花或不同产地菊花多成分比较分析有报道［13-15］，但就亳菊及其伪品大马牙内在5种成分及其总挥发油含有量比较分析未见报道。通过实验测得数据发现亳菊中绿原酸、木犀草苷、槲皮素和金合欢素含有量均高于大马牙，大马牙中绿原酸和木犀草苷含有量很低在线性范围内未测得，但大马牙中黄芩苷含有量达0.905%，比亳菊高出4倍多。毫菊总挥发油提取率高于大马牙。通过数据比较分析可得出，2种菊花内在成分及含有量存在一定差异，不能简单用大马牙伪充亳菊入药。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：292，附录XD.

［2］于 娇，俞年军，郑太华，等.亳州产4种药用菊花栽培品种内在质量的比较研究［J］.安徽中医学院学报，2013，32（6）：86-88.

［3］Kimata M，Inagaki N，Nagai K.Effect of luteolin and other flavonoids on IgnE-mediated allergic reaction［J］.Planta Med，2000，66：25-29.

［4］孙 涓，余世春.槲皮素的研究进展［J］.现代中药研究与实践，2011，25（3）：85-88.

［5］赵声兰，陈朝银.天然食物中的抗艾滋病有效成分［J］.食品与机械，2007，23（3）：166-170.

［6］Hsu Yaling，Kuo Polin，Lin Chunching.Acacetin inhibits the proliferation of Hep G2 by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis［J］.Biochem Pharmacol，2004（67）：823-829.

［7］施剑明，殷嫦嫦，殷 明，等.野菊花总黄酮联合顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞抑制作用［J］.中成药，2014，36（10）：2013-2017.

［8］王德群，刘守金，梁益敏.中国菊花药用类群研究［J］.安徽中医学院学报，2001，20（1）：45-47.

［9］覃 珊，温学森.HPLC同时测定菊花中6种活性成分含量［J］.中药材，2011，36（11）：1474-1477.

［10］程宏英，冯启余，曹玉华，等.菊花中活性成分的高效液相色谱测定与指纹图谱研究［J］.分析科学学报，2007，23（3）：257-262.

［11］于 艳，时维静，邓家胜，等.菊花中7种化合物HPLC检测方法的建立［J］.安徽科技学院学报，2012，26（5）：43-48.

［12］吴金爽，吴德玲，俞年军，等.RP-HPLC法同时测定亳菊总黄酮中3种黄酮类成分［J］.中成药，2013，35（4）：774-776.

［13］朱 丽，卢 化.HPLC法测定药用菊花中木犀草素的含量［J］.湖北中医杂志，2010，32（2）：74-75.

［14］戴 胜，张 明，程文明，等.HPLC测定野菊花药材中8种黄酮和有机酸的含量［J］.中国中药杂志，2013，38（12）：1961-1965.

［15］袁 琦，赵 辉，蒲晓辉，等.HPLC法同时测定菊花中绿原酸黄芩苷和槲皮素的含量［J］.沈阳药科大学学报，2014，31（2）：112-114.

Com parison of chlorogenic acid，flavonoids and volatile oils between Boju and Da maya

WANG Fu-cheng1， SHIWei-jing2， GONG Dao-feng1， CHENG Lei1， JIDong-han1
（1.Bozhou Institute of Chinese Materia Medica，Anhui Academy of Chinese Medicine，Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou 236800，China；2.Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China）

AIMTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of chlorogenic acid，galuteolin，baicalin，quercetin and acacetin in Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Boju'cv. nov.and D.morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Da maya'cv.nov.formedicinal choice.METHODSThe analysis of chlorogenic acid and flavonoidswas carried out on Shim-pack C18（4.6 mm×250 mm，5μm）.Themobile phase consisted ofwater contained acetonitrile（A）and 0.1%phosphoric acid aqueous solution（B）in a gradient elution manner.The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 30℃，and the detection wavelength was set at348 nm.The total content of volatile oil wasmeasured.RESULTSThe linear relationships of chlorogenic acid，galuteolin，baicalin，quercetin and acacetin were in the ranges of 0.5-5.0μg，0.11-1.1μg，0.74-7.4μg，0.39-3.9μg，and 0.28-2.8μg，respectively.Their average recovery rates were 99.3%（RSD=2.0%），99.3%（RSD=2.0%），99.7%（RSD=1.9%），99.1%（RSD=2.0%），and 98.0%（RSD=1.8%），respectively.Their volatile oil yields were 0.52%and 0.42%，respectively.The contents of chlorogenic acid，galuteolin，quercetin，acacetin and volatile oil in Boju were higher than that of Da maya.The baicalin content in Da maya was higher than that of Boju.CONCLUSIONDa maya contains so low contents ofchlorogenic acid and galuteolin that it can not take the place of Boju in clinic use.

Dendranthemamorifolium（Ramat.）Tzvel.‘Boju'cv.nov.；Dendranthemamorifolium（Ramat.）Tzvel.‘Da maya'cv.nov；chlorogenic acid；galuteolin；baicalin；quercetin；acacetin；volatile oil

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1534-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.030

2015-01-16

安徽省高等教育振兴计划人才项目 （皖教秘人 ［2014］181号）；安徽省高等学校省级质量工程项目 （2014jxtd073，2013sxzx035）；安徽省省级专业带头人资助项目 （皖教秘人 ［2011］2号）；安徽省高校省级自然科学研究项目 （KJ2010B418）

王甫成 （1979—），男，副教授，硕士，主要从事中药加工炮制及质量标准研究。Tel：（0558）5587026，E-mail：wfc520@ 126.com