牡荆素对急性肺损伤小鼠的保护作用

罗 丽， 江 涛， 陈 聂

（重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016）

[药理]

牡荆素对急性肺损伤小鼠的保护作用

罗 丽， 江 涛*， 陈 聂

（重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016）

目的研究牡荆素对C57BL/6雄性小鼠急性肺损伤的保护作用。方法采用脂多糖（LPS）7mg/kg腹腔注射建立急性肺损伤小鼠模型。72只模型小鼠随机分为正常组、牡荆素对照组、模型组、牡荆素治疗低、中、高剂量组。观察小鼠一般情况，检测6 h后肺湿/干质量比 （W/D），肺组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）水平，肺泡灌洗液中总蛋白水平，光镜下观察肺组织病理变化，检测肺组织中NF-κBp65 mRNA的表达。结果与模型组相比，牡荆素低、中、高剂量组剂量依赖性地降低肺组织中TNF-α、MDA水平和肺泡灌洗液中总蛋白水平，升高SOD水平，降低肺湿质量/干质量比值，减轻病理损伤程度，抑制NF-κBp65 mRNA的表达 （P＜0.05）。结论牡荆素能通过抗炎、抗氧化作用对急性肺损伤小鼠产生保护作用。

牡荆素；急性肺损伤；脂多糖

急性肺损伤属于临床急危重症，以急性低氧性呼吸功能不全为主要临床特征，以肺内过度、失控的炎性反应为发病本质，感染是导致发病的常见原因［1］。急性肺损伤病死率高，病情进展快，后期治疗效果差，临床用药选择较少。牡荆素取材广泛，国内多从蔷薇科植物山楂成熟果实中提取，属于黄酮类化合物［2］，具有明确的抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用［3-5］，既往多用于治疗心血管疾病。近年来研究表明，在小鼠肺炎症模型中，牡荆素能抑制80%的中性粒细胞聚集［6］，但牡荆素用于急性肺损伤的研究却少见报道。因此本实验以脂多糖（LPS）作为致伤剂，复制急性肺损伤模型，使用低、中、高3种剂量牡荆素早期干预小鼠，测定肺组织中多种炎症介质和氧化指标，检测肺组织中NF-κBp65 mRNA的表达，了解牡荆素对急性肺损伤小鼠是否具有保护作用，为临床用药提供更进一步选择。

1 材料和方法

1.1 材料 牡荆素（≥95%）购于Sigma公司，临用前将其溶于DMSO中。脂多糖 （LPS）（O55：B5）购于 Sigma公司。小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号M130916-12a）的ELISA试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司。小鼠超氧化物歧化酶（SOD，批号 20130828）、丙二醛 （MDA，批号20130831）试剂盒购于南京建成生物工程研究所。BCA蛋白测定试剂盒（NO.23225）购于Thermo公司。Trizol总RNA提取试剂、反转录及PCR试剂盒由thermo Fermentas公司提供。

1.2 实验分组及模型建立 SPF级雄性C57BL/6小鼠72只，由成都达硕生物科技有限公司提供。普通饲养，观察一周无异常后，随机等分为以下6组：正常组、牡荆素对照组、模型组、牡荆素低剂量组（0.3 mg/kg）、中剂量组（1 mg/kg）、高剂量组 （3 mg/kg）。参照文献及预实验结果复制急性肺损伤小鼠 （7 mg/kg LPS腹腔注入［7］）的动物模型。药物组于注入LPS 30 min后腹腔注射牡荆素，模型组注入LPS 30 min后腹腔注射等量生理盐水。正常组和牡荆素对照组在注入等量生理盐水30 min后分别腹腔注射等量生理盐水和牡荆素（3 mg/kg）。6 h后断颈处死小鼠。

1.3 一般情况观察 成功造模分组后每小时观察动物的精神、体温、饮食、呼吸、活动等情况。

1.4 肺组织病理学检测 取小鼠左肺下叶肺组织固定于体积分数为4%的多聚甲醛溶液中，组织石蜡包埋，切片HE染色，光镜下观察肺组织病理情况，并参照Kendra半定量评分标准［8］对组织损伤进行评分。

1.5 肺湿质量/干质量比（W/D）测定 开胸分离肺组织，左肺上叶称定质量后，置烤箱 （80℃，20 h）烤至恒定质量，称干质量，计算W/D。

1.6 BCA法检测肺泡灌洗液中总蛋白水平 造模6 h后处死小鼠，消毒颈部皮肤后，剪开皮肤、分离气管，将消毒后的导管插入气管远心端，预冷的生理盐水1 mL灌洗气管2次，每次停留约30 s，回收灌洗液约1.5 mL，离心后取上清液，按说明书操作。

1.7 ELISA法检测肺组织中TNF-α水平 取右肺中叶肺组织，用PBS液作为匀浆介质，破碎肺组织后，离心取上清液，按试剂盒说明书步骤操作，在酶标仪450 nm处测定吸光度，计算每个样本的TNF-α的水平。

1.8 比色法测定肺组织中SOD、MDA水平 右肺中叶组织匀浆，取上清液，按试剂盒说明书步骤，在酶标仪490 nm处测定吸光度，计算每个样本的SOD、MDA的水平。

1.9 半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测NF-κBp65 mRNA的表达 提取肺组织总RNA后，按照试剂盒进行反转录，合成cDNA，后扩增PCR。NF-κBp65引物序列：正向为5′-TGCGATTCCGCTATAAATGCG-3′，反向为5′-ACAAGTTCATGTGGATGAGGC-3′，扩增片段长度178 bp。β-actin引物序列：正向为5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，反向为5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，扩增片段长度260 bp。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min后，按95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，72℃10 min，循环35次，最后10℃cycle。琼脂糖凝胶电泳后，Image-J软件分析并拍摄图像，NF-κBp65表达水平以其与β-actin的相对表达量计算。

1.10 统计学处理 数据用均数±标准差表示，使用Spass 17软件进行多个样本均数比较的方差分析，采用Bonferroni法进行组间比较，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况观察 模型组小鼠在LPS腹腔注射2 h后，开始出现行动迟缓、萎靡不振，相互聚集，很少进食，6 h后行动更加迟缓，用手触碰也懒于活动，毛发杂乱、无光泽，并有明显的竖立现象，分泌物增多，但仍然存活。药物治疗组小鼠约3 h开始出现聚集、依偎，行动减少。

2.2 肺组织中TNF-α、MDA水平和SOD活性变化

与正常组相比，模型组小鼠肺组织中TNF-α、MDA水平显著升高，牡荆素低、中、高剂量组均能降低LPS所致肺损伤小鼠肺组织体内TNF-α、MDA水平 （P＜0.05）。与正常组相比，模型组小鼠肺组织中SOD活性明显降低，药物中、高剂量组小鼠体内SOD活力升高 （P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠肺组织中TNF-α、MDA水平和SOD活性(n=6,x±s)Tab.1 Levels of TNF-α,IL-10,MDA,SOD activity inlung tissue in each group(n=6,x±s)

2.3 肺泡灌洗液中总蛋白含有量变化和肺湿质量/干质量

腹腔注射LPS 6 h后，模型组小鼠总蛋白含有量较正常组明显升高。牡荆素低、中、高剂量组总蛋白含有量较模型组有明显降低 （P＜0.05）。与正常组相比，模型组肺组织W/D明显升高 （P＜0.05），牡荆素中、高剂量组与模型组比较，W/D比值明显降低 （P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肺泡灌洗液中总蛋白含有量、W/D、病理评分(n=6,x±s)Tab.2 Contents of total protein in alveolar lavage in eachgroup(n=6,x±s)

2.4 肺组织病理变化 正常组和牡荆素对照组肺组织结构完整，肺泡壁无增厚，肺泡腔内无中性粒细胞大量渗出，无充血水肿；模型组肺组织结构破坏，肺泡充血水肿明显，部分可见出血，大量中性粒细胞渗出；牡荆素低、中、高剂量组肺损伤较模型组均有一定程度减轻，以高剂量组明显，表现为肺组织充血水肿减轻，无出血，肺泡壁增厚减轻，炎性细胞浸润有所减少。见图1。与正常组相比，模型组肺组织病理学评分明显增加 （P＜0.05），牡荆素低、中、高剂量组干预后肺组织病理学评分明显降低 （P＜0.05）。见表2。

图1 光镜下各组小鼠肺病理学改变 (HE x 400)Fig.1 Lung pathology changes in each group by lightm icroscopy(HE x 400)

2.5 肺组织中NF-κBp65 mRNA的表达 与正常组对比，模型组NF-κBp65 mRNA表达水平明显升高 （P＜0.05），牡荆素低、中、高剂量与模型组对比，NF-κBp65 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。见表3，图2。

表3 各组小鼠肺组织中NF-κBp65 m RNA表达的相对值(n=6,x±s)Tab.3 Effects of vitexin on LPS-induced lung W/D(n= 6,x±s)

图2 RT-PCR检测NF-κBp65mRNA表达的电泳图Fig.2 E lectrophoregram of NF-κBp65 m RNA expression by RT-PCR detection

3 讨论

小鼠LPS腹腔内注射为经典的诱导急性肺损伤的造模方法［9］。在本实验中，模型组小鼠呼吸窘迫、毛发竖立、腹泻、相互偎依，W/D增高，肺泡灌洗液总蛋白含有量升高，肺组织中炎症介质如TNF-α、MDA水平升高，病理切片可见明显肺泡上皮-毛细血管屏障破坏，炎症细胞大量聚集，表明急性肺损伤模型制备成功。

LPS诱导的急性肺损伤的本质是过度失控的炎症反应。TNF-α作为启动急性肺损伤重要的细胞因子，可直接触发中性粒细胞的激活，释放细胞毒性介质，加重肺损伤。本实验中，模型组小鼠炎症介质TNF-α升高，牡荆素低、中、高剂量组TNF-α水平明显低于模型组，且呈剂量依赖性，说明牡荆素能通过抑制TNF-α的产生而达到保护肺组织的目的。

急性肺损伤时，体内氧化/抗氧化平衡失调，引发机体产生剧烈氧化应激反应，加重肺损伤。MDA能间接判断细胞膜受损严重程度，SOD是机体内重要的抗氧化酶，能间接反映机体内清除氧自由基的能力［10］。本实验发现，牡荆素中、高剂量组均能降低肺损伤时MDA水平，改善SOD活力。由此推测，牡荆素可以通过抑制急性肺损伤时肺组织细胞膜的过氧化，从而减轻肺损伤。

腹腔注射LPS 6 h后，模型组小鼠肺组织切片提示肺泡充血水肿明显，肺泡间隔增宽，炎症细胞浸润，而牡荆素组肺组织损伤较模型组明显减轻，且与剂量相关。肺损伤时内皮细胞-毛细血管膜完整性缺失，通透性增加，富含蛋白的渗出液充斥在肺泡及间质中［11］。本实验中发现模型组与正常组比较，W/D明显升高，蛋白浓度增加，而经过牡荆素干预的小鼠，上述数值均有所降低，以牡荆素中、高剂量表现明显，表明牡荆素能降低LPS引发的肺组织通透性的升高。

P50和p65组建的异源二聚体构成了典型的NF-κB，NF-κB作为快反应转录因子，存在于胞浆中，在体内刺激因素（如LPS）存在时，NF-κB活性状态发生改变，迅速转入细胞核中，调节炎症介质基因的表达，促进炎性反应失控，导致肺损伤的发生及发展。本实验中，药物干预组NF-κBp65的表达比模型组弱，这提示可能与牡荆素通过抑制NF-κBp65 mRNA的表达有关。

综上所述，牡荆素能通过抑制炎症介质的产生，减轻脂质过氧化反应，降低肺组织的通透性，从而使肺组织损伤减少，这可能与牡荆素能抑制NF-κBp65 mRNA的表达有关，其具体机制有待进一步研究。

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Protective effect of vitexin on m ice w ith acute lung injury

LUO Li， JIANG Tao*， CHEN Nie
（Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

AIMTo study the protective effect of vitexin on male C57BL/6 mice with acute lung injury.METHODSLipopolysaccharide（LPS，7 mg/kg）was injected through the abdominal cavity to inducemice with acute lung injury.Seventy-twomoldedmice were randomly divided into six groups：the normal group，vitexin control group，themodel group，vitexin low，middle，and high dose groups.The general conditionswere observed for all experimentalmice.The ratio ofwet to dry weight lung tissue（W/D）and the levels of tumor necrosis factor alpha（TNF-α），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）in lung tissues were determined in six hours.The levels of total protein in alveolar lavage fluid were detected.The histopathological changes of lung tissueswere observed under lightmicroscope.The expressions of NF-κBp65 mRNA were measured.RESULTSCompared with themodel group，vitexin groups significantly decreased the levels of TNF-αand MDA in lung tissues and the total protein level in alveolar lavage fluid while increased the contents of SOD，reduced lungwet/dry weight ratio，attenuated pathological changes of lung tissues，and suppressed the expression of NF-κBp65 mRNA in a dose-dependentmanner（P＜0.05）.CONCLUSIONVitexin has protective effecton mice with acute lung injury through anti-inflammatory and antioxidant route.

viexin；acute lung injury；lipopolysaccharide

R966

：A

：1001-1528（2015）07-1393-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.001

2014-12-15

罗 丽 （1982—），女，硕士生，主治医师，研究方向为肺损伤治疗。Tel：18202354978，E-mail：826333463@qq.com

*通信作者：江 涛，女，教授，研究方向为肺损伤、肺纤维化的治疗。Tel：13996122790，E-mail：j.tcq@163.com