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川芎含药血清对大鼠肝星状细胞大麻素受体1相关信号通路的影响

2015-01-16曹文富王海兰韩仕庆

中成药 2015年7期
关键词:星状含药大麻

何 娟, 曹文富,2*, 王海兰, 韩仕庆

(1.重庆医科大学中医药学院,重庆400016;2.重庆医科大学中医药研究室,重庆400016)

川芎含药血清对大鼠肝星状细胞大麻素受体1相关信号通路的影响

何 娟1, 曹文富1,2*, 王海兰1, 韩仕庆1

(1.重庆医科大学中医药学院,重庆400016;2.重庆医科大学中医药研究室,重庆400016)

目的观察川芎含药血清对血小板源生长因子(PDGF-BB)活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)大麻素受体1(CB1)、黏着斑激酶 (FAK)及磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 (p-Akt)蛋白表达的影响,探讨其抗纤维化的作用机制。方法制备川芎含药血清,MTT法检测川芎含药血清对肝星状细胞增殖情况,Western blot法分析肝星状细胞CB1、FAK、p-Akt蛋白的表达。结果与正常对照组相比,PDGF-BB作用24 h能刺激HSCs增殖,上调CB1、FAK、p-Akt蛋白的表达;川芎含药血清、秋水仙碱及大麻素受体1抑制剂AM251均能明显抑制上述效应;且加入AM251后,川芎含药血清对上述效应的抑制效果增强,且作用呈剂量依赖性。结论川芎含药血清可能通过大麻素相关信号通路抑制HSCs增殖,从而发挥防治肝纤维化的作用。

川芎含药血清;肝纤维化;肝星状细胞;大麻素受体1相关信号通路;黏着斑激酶;磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

内源性大麻素系统(endogenous cannabinoid system,ECS)是由内源性大麻素、大麻素受体及参与生物合成、降解的酶组成,主要分布于脑部,在外周组织也有分布,包括肝脏。在神经系统、免疫调节、心血管系统、能量代谢等方面均发挥着重要作用。近期研究发现,整个肝脏均有CB1(cannabinoid receptor 1)、CB2低水平表达,在肝脏受损时表达水平明显上调,并在慢性肝病发生发展过程中起重要作用[1]。具有活血化瘀功能的中药川芎在防治肝纤维化方面一直是研究的热点,本实验以血小板源生长因子(PDGF-BB)为刺激因子,观察川芎含药血清对大鼠HSCs(hepatic stellate cells)增殖及CB1、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)及磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,p-Akt)表达的影响,进一步阐明川芎抗纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 肝星状细胞 大鼠肝星状细胞购买于重庆医科大学附属第二医院消化科。在含体积分数为10%胎牛血清、含青链霉素各100 U/mL的改良型1640培养基、37℃、CO2体积分数5%、饱和湿度的条件下培养细胞,用0.25%胰酶消化传代。

1.1.2 主要试剂 血小板源性生长因子(PDGFBB)购自美国PEPROTECH公司,大麻素受体1抑制剂(AM251)购自美国Selleck公司,兔抗人CB1多克隆抗体、兔抗人FAK多克隆抗体、兔抗人p-Akt多克隆抗体购自北京博奥森公司,胎牛血清、0.25%胰酶、改良型1640购自Hyclone公司。

1.1.3 中药水煎剂的制备 川芎购于重庆医科大学附属第一医院中药房,按 “动物与人体的千克体质量折算系数表” (成人与大鼠折算系数为6.25),计算大鼠灌胃剂量,得出大鼠相对于成人临床等效剂量为1.06 g/kg,按照2倍、4倍来选择剂量,得出小剂量为2.12 g/kg,大剂量为4.24 g/kg。加水煎煮,滤过备用。秋水仙碱由西双版纳药业有限责任公司生产 (国药准字H53021369)。

1.1.4 川芎含药血清的制备 清洁级SD雄性大鼠40只 (购自重庆医科大学实验动物中心,动物合格证号:SYXK(渝)2012-0001),体质量180~220 g。随机分为空白对照组、川芎小剂量组、川芎大剂量组、秋水仙碱组,每组10只,川芎灌胃小剂量为2.12 g/kg,大剂量为4.24 g/kg,空白对照组给予等量的生理盐水,秋水仙碱以0.1 mg/kg灌胃,各组均按每天1 mL/100 g给药,1次/d,连续10 d,最后1次给药1 h后乙醚麻醉,无菌条件下心脏采血,静置后离心10 min,吸取血清,血清用0.22μm滤器过滤,即为药物血清;所有血清均经56℃、30 min灭活,置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 肝星状细胞实验分组 实验分为8组,AM251终浓度为10μmol/L、PDGF-BB终质量浓度为10 ng/m L,每组血清添加量为10%。正常对照组 (A组)细胞给予正常大鼠血清;模型组 (B组)细胞给予正常大鼠血清+PDGF-BB;AM251组(C组)细胞给予正常大鼠血清+PDGF-BB+ AM251;秋水仙碱组 (D组)细胞给予秋水仙碱血清+PDGF-BB;川芎小剂量组(E组)细胞给予川芎小剂量含药血清+PDGF-BB;川芎大剂量组(F组)细胞给予川芎大剂量含药血清+PDGF-BB;川芎小剂量+AM251组 (G组)细胞给予川芎小剂量含药血清+AM251+PDGF-BB;川芎大剂量+ AM251组 (H组)细胞给予川芎大剂量含药血清+AM251+PDGF-BB;含药血清与AM251同时加入除正常对照组外,各组分别处理细胞1 h后再用PDGF-BB刺激。

1.2.2 Western blot法检测AM251对CB1蛋白表达的影响 将传代培养的HSC按常规方法1×106个/m L接种于6孔板中,用含10%胎牛血清的改良型1640培养液培养,每孔2 m L,培养24 h后,待细胞近铺满孔底80%时,吸弃上清,将细胞分为6组,即空白组、模型组、1μmol/L组、3 μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组;除正常对照组外,各组分别处理细胞1 h后再加入刺激剂PDGF-BB,培养24 h后分别收集细胞。经蛋白上样、电泳、转膜、封闭、加入一抗4℃过夜、漂洗、加入二抗、孵育、漂洗。采用化学发光法进行显色反应,重复3次,结果用光密度扫描仪记录,并进行统计分析。以GAPDH表达水平为内参照。目标蛋白的表达量以目标蛋白与内参照蛋白灰度值的相对比值表示。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖情况 取对数生长期细胞,0.25%胰酶消化后用含10%胎牛血清的改良型1640培养液制成单细胞悬液,调整细胞数为1×105个/mL接种于96孔板。培养24 h后吸弃孔内上清液,按实验分组加入相应血清及试剂,培养1 h后加入刺激因子。每组设5个复孔。培养24 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20μL,37℃继续孵育4 h,终止培养,弃上清,每孔加入200μL DMSO,振荡10 min,在酶联免疫检测仪上取570 nm波长,测定各孔吸光度 (OD)值。

1.2.4 Western blot法检测CB1、FAK及p-Akt蛋白的表达情况 将传代培养的HSC按常规方法1× 106个/mL接种于6孔板中,用含10%胎牛血清的改良型1640培养液培养,每孔2 mL,培养24 h后,待细胞近铺满孔底80%时,吸弃上清,按前述细胞实验分组处理细胞,培养24 h后分别收集细胞。经蛋白上样,10%SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,加入一抗4℃过夜,TBST漂洗30 min,分别加入二抗,37℃孵育,TBST漂洗30 min。采用化学发光法进行显色反应,重复3次,结果用光密度扫描仪记录,并进行统计分析。以GAPDH表达水平为内参照。目标蛋白的表达量以目标蛋白与内参照蛋白灰度值的相对比值表示。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学分析,以 (x±s)表示均数间差异的实验结果,采用One-Way ANOVA检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AM251对肝星状细胞CB1表达的影响 与空白对照组比较,PDGF-BB刺激作用24 h后CB1表达显著上调(P<0.05)。与模型组比较,1μmol/L组、3μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组CB1表达明显降低 (P<0.05),且呈剂量依赖关系(P<0.05),具体见表1,Western blot图片见图1。

2.2 川芎含药血清对HSCs增殖的影响 PDGFBB(10 ng/mL)作用于培养的大鼠肝星状细胞24 h后,应用MTT检测,模型组吸光度OD值明显高于对照组 (P<0.05)。经秋水仙碱、AM251、川芎小剂量与大剂量处理后,各组OD值明显降低(P<0.05),且川芎大剂量组比小剂量组抑制作用更明显 (P<0.05)。加入AM251后,川芎小、大剂量含药血清对肝星状细胞增殖作用的抑制更强(P<0.05),且呈明显的剂量效应关系 (P<0.05),见表2。

表1 AM 251对肝星状细胞CB1表达的影响(x±s,n=4)Tab.1 Effects of AM 251 on CB1 in Hepatic Stellate Cells (x±s,n=4)

图1 AM 251对肝星状细胞CB1表达的影响Fig.1 Effects of AM 251 on CB1 in Hepatic Stellate Cells

表2 川芎含药血清对PDGF-BB刺激的HSCs增殖的影响(x±s,n=4)Tab.2 Effects of Ligusticum chuanxiong Hort d rug-containing serum on the proliferation in HSCs stimulated by PDGF-BB(x±s,n=4)

2.3 川芎含药血清对大鼠肝星状细胞CB1、FAK、p-Akt蛋白表达的影响 与对照组比较,HSCs经PDGF-BB刺激24 h后CB1、FAK、p-Akt蛋白表达显著上调 (P<0.05)。与模型组比较,秋水仙碱组、AM251组、川芎小剂量组与大剂量组CB1、FAK、p-Akt蛋白表达显著下调(P<0.05),且川芎大剂量组比川芎小剂量组下调更明显 (P<0.05)。加入AM251后,川芎含药血清对所测蛋白的抑制作用更显著 (P<0.05),且呈剂量依赖关系(P<0.05),见表3,Western blot图片见图2。

表3 川芎含药血清对肝星状细胞CB1、FAK、p-Akt蛋白的影响(x±s,n=4)Tab.3 Effects of Ligusticum chuanxiong Hor t drug-containing serum on CB1,FAK and p-Akt in HSCs(x±s,n=4)

图2 川芎含药血清对大鼠肝星状细胞CB1、FAK、p-Akt蛋白的影响Fig.2 Effects of Ligusticum chuanxiong Hort drugcontaining serum on CB1,FAK and p-Ak t in HSCs

3 讨论

肝纤维化是由各种致病因素所致慢性肝病的重要病理特征,其特征是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积于肝脏,也是“慢性肝病-肝纤维化-肝硬化”发展的中间环节[2-4]。活化的肝星状细胞是肝纤维化时ECM的主要细胞来源,在肝纤维化中起关键作用[5-7]。

内源性大麻素系统 (ECS)是由内源性大麻素、大麻素受体及参与生物合成、降解的酶组成,主要通过大麻素受体发挥作用,目前发现体内主要有大麻素受体1(CB1)和大麻素受体2(CB2)两种。以往学者对ECS的研究主要集中在神经系统、免疫系统和心血管系统等方面,总结出它与神经系统、记忆、能量代谢、肿瘤、免疫调节和心血管系统等疾病密切相关[8]。近期研究发现,整个肝脏均有CB1、CB2低水平表达,在肝脏受损时表达水平明显上调,并在慢性肝病发生发展过程中起重要作用。CB1和CB2在肝纤维化发生发展过程中的作用不同,前者具有促进肝纤维化的作用,后者具有抗肝纤维化的作用[9]。

PI3-K/Akt信号通路通过调控基因表达,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多种生理和病理过程中发挥重要作用[10],尤其在肝纤维化的进展中,此通路发挥了重要调节作用。它主要由FAK-PI3KAkt-p70S6激酶等连接而成。FAK是一种介导多种信号向细胞内转导的非受体酪氨酸蛋白激酶,它是细胞内多条转导通路的交汇点。具有丝氨酸、苏氨酸激酶活性的Akt,又称蛋白激酶B,它是PI3K通路下游的一个重要靶激酶[11]。它主要通过磷酸化含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物发挥各种生物学效应,如促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等。活化的PI3K可使蛋白激酶C、Akt和p70S6K等多种激酶激活[12],激活的Akt主要作用于p70S6K,使其活化,从而影响HSCs增殖[13]。因此,阻断PI3K/ Akt信号通路为防治肝纤维化的重要途径。

研究证明,CB1为G蛋白偶联受体,它与Gi/o蛋白偶联后,由Gi/o蛋白介导信号转导。Gi/o蛋白活化后,其亚单位α和βγ分离。而Gβ/γ亚单位可激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K),使PI-3K/ PKB/Akt信号增强,从而促进细胞的生长分化[14];或者通过对ERK1/2磷酸化的调节,促进髓鞘的再生。综上所述,CB1可能通过激活PI3-K/PKB/Akt信号通路影响HSCs的增殖而在肝纤维化过程中起着重要作用。

本研究结果显示,与空白对照组相比,经PDGF-BB作用24 h后,HSCs明显增殖(P<0.05),CB1、FAK、p-Akt蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,秋水仙碱组、AM251组、不同剂量川芎含药血清组及不同剂量川芎含药血清+AM251组均能明显抑制HSCs增殖(P<0.05),且明显下调CB1、FAK、p-Akt蛋白的表达(P<0.05);与川芎小剂量组相比,川芎大剂量组HSCs增殖及CB1、FAK、p-Akt蛋白表达情况明显受到抑制 (P<0.05);与AM251组比较,不同剂量川芎含药血清+AM251组HSCs增殖及CB1、FAK、p-Akt蛋白表达情况明显降低 (P<0.05),且呈剂量依赖关系 (P<0.05);与川芎小剂量组比较,川芎小剂量+AM251组HSCs增殖明显降低(P<0.05),且CB1、FAK、p-Akt蛋白表达明显下调 (P<0.05);与川芎大剂量组比较,川芎大剂量+AM251组HSCs增殖亦明显降低(P<0.05),且明显抑制CB1、FAK、p-Akt蛋白的表达(P<0.05)。上述结果显示,PDGF-BB作用24 h能刺激HSCs增殖,上调CB1、FAK、p-Akt蛋白的表达;秋水仙碱、AM251及川芎含药血清均能明显抑制上述效应;且加入AM251后的川芎含药血清比单独使用相应剂量的川芎含药血清对HSCs增殖及CB1、FAK、p-Akt蛋白表达的抑制效果更强,作用呈剂量依赖性。由此说明,川芎含药血清影响肝星状细胞的增殖可以通过抑制大麻素受体1进而影响PI3-K/Akt信号通路来实现,最终发挥抗纤维化的作用,但具体机制仍未完全清晰,临床应用仍局限于激动剂与拮抗剂的使用,且作用于临床的药物实验较少,不良反应尚未完全明确,因此,尚须对大麻素受体在肝纤维化发生发展中的作用进行更深入全面的研究,以期为肝纤维化的治疗提供新的途径和靶点。

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Effects of serum containing Ligusticum chuanxiong on CB1 related signaling pathway in rat hepatic stellate cells

HE Juan1, CAOWen-fu1,2*, WANG Hai-lan1, HAN Shi-qing1
(1.School of TCM,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Research Laboratory of TCM,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

AIMTo investigate the effects of serum containing Ligusticum chuanxiong on cannabinoid receptor 1(CB1),focal adhesion kinase(FAK)and extracellular regulated protein kinase(p-Akt)in rat hepatic stellate cells(HSCs)stimulated by platelet-derived growth factor(PDGF-BB)and to explore themechanism of hepatic fibrosis.METHODSThe effect of prepared s erum containing Ligusticum chuanxiong on the proliferation of HSCs was detected by MTT assay;the protein levels of CB1,FAK,and p-Akt were analyzed by Western blot.RESULTSCompared to the normal control group,24 hours treatment of PDGF-BB promoted the proliferation of HSCs significantly and increased the protein levels of CB1,FAK,and p-Akt;serums containing Ligusticum chuanxiong,colchicine and AM251 could distinctly inhibit the above effects in HSCs.After adding AM251,the inhibitory effectof serum containing Ligusticum chuanxiong wasmore apparent and showed a dose-dependentmanner.CONCLUSIONThe serum containing Ligusticum chuanxiong plays the role in the prevention and treatment ofhepatic fibrosis by inhibiting the proliferation of HSCs through CB1 related signaling pathway.

serum containing Ligusticum chuanxiong;hepatic fibrosis;hepatic stellate cells;cannabinoid receptor 1(CB1)related signaling pathway;focal adhesion kinase(FAK);extracellular regulated protein kinase(p-Akt)

R285.5

:A

:1001-1528(2015)07-1397-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.002

2014-09-18

国家自然科学基金预研项目 (NSFYY-2011)

何 娟 (1987—),女,硕士生,主要从事肾病与内分泌、器官纤维化研究。Tel:18223595095,E-mail:970275873@ qq.com

*通信作者:曹文富,男,教授,主要从事肾病与内分泌、器官纤维化研究。Tel:13883658367,E-mail:13883658367@163.com

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