高效液相色谱法测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量

刘 琴 ，潘文琴(1．杭州市拱墅区康桥街道社区卫生服务中心，杭州 3100;．浙江工业大学药学院，杭州310015)

金银花化学成分复杂，现已鉴别出70 多种。对金银花及其枝叶的有效成分绿原酸的含量测定方法较多，但对木犀草苷的测定报道较少。使用高效液相色谱(HPLC)法测定金银花中绿原酸和木犀草苷的鲜有研究。本文探索并优化HPLC法，选择最佳的色谱条件，测定金银花中绿原酸和木犀草苷这2 个有效成分的含量。

1 材料

1.1 仪器与试药

岛津LC-10ATvp 高效液相色谱仪;R224CN 电子天平;KQ3200 超声波清洗器。

1.2 药品与试剂

绿原酸对照品(批号:12031401，成都曼思特生物科技有限公司生产);木犀草苷对照品(批号:10122401，成都曼思特生物科技有限公司生产);金银花药材:为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾及初开的花(华东医药有限公司生产)。甲醇(色谱纯，TEDIA Company．INC 生产);乙睛(色谱纯，上海汇普工业化学品有限公司生产);超纯水、冰乙酸(分析纯，杭州市北大桥化工区生产);乙醇(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司生产);精密pH 试纸0．45 μm;微孔滤膜。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:依利特Hypersil ODS2(4．6 mm×250 mm，5 μm);流动相:0．5% 冰乙 酸-乙腈;线性梯度洗脱:0～20 min(90∶10～78 ∶22)，20～35min(78 ∶22～76 ∶24)，35～37min(76 ∶24～65 ∶35)，37～40 min(65 ∶35～90 ∶10);流 速:1．0 ml/min;检测波长:绿原酸326 nm，木犀草苷350 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μl。

2.2 溶液的制备

2．2．1 供试品溶液的制备:(1)金银花供试品溶液的制备:精密称取金银花粉末0．5 g，置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，称定质量，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤。(2)绿原酸供试品溶液的制备:精密移取上述滤液5～25 ml 置容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀即得。(3)木犀草苷供试品溶液的制备:精密移取上述滤液1～10 ml 置容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀即得。

2．2．2 对照品溶液的配制:(1)绿原酸对照品溶液的制备:精密称定绿原酸对照品10．0 mg，用70% 甲醇溶解并转移置100 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀。(2)木犀草苷对照品溶液的制备:精密称定木犀草苷对照品10．0 mg，用70%甲醇溶液并转移置50 ml 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀。精密移取上述溶液1～50 ml 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀。(3)流动相溶液0．5%冰乙酸的配制:量取2．5 ml 冰乙酸，用重蒸水定容至500 ml，混合均匀，测定pH 值，用0．45 μm微孔滤膜过滤，并超声脱气20 min，备用。

2.3 色谱条件的选择

2．3．1 绿原酸检测波长的确定:进绿原酸对照品溶液10 μl，扫描波长，结果显示，在波峰达100 mAV 时，绿原酸的检测波长范围在300～340 nm，最佳检测波长为326 nm。

2．3．2 木犀草苷检测波长的确定:进木犀草苷对照品溶液10 μl，扫描波长，结果显示，在波峰达175 mAU 时，木犀草苷的检测波长范围在245～270 nm/330～360 nm，最佳检测波长为350 nm。

2.4 流动相的确定

2．4．1 流动相配比:流动相为:0．5%冰乙酸-乙腈(A-B)。实验以洗脱时间为因素，经15 次无机相和有机相配比调整，得绿原酸和木犀草苷色谱图。观察两者分离效果。结果表明:最佳的流动相配比为:0～20 min(90∶10～78∶22)，20～35 min(78∶22～76∶24)，35～37 min(76∶24～65∶35)，37～40 min(65∶35～90∶10)，该流动相分离效果好，峰形好，且峰高和峰面积较高。第13 个流动相色谱图见图1，其他14 个配比流动相比例的分离效果均不理想。

图1 绿原酸和木犀草苷色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Chlorogenic acid and Luteoloside

2．4．2 其他条件的确定:多次试验验证，柱温为30 ℃、流速为1．0 ml/min 时，金银花中绿原酸和木犀草苷的分离效果良好。

2.5 线性关系考察试验

分别精密移取绿原酸对照品溶液2、4、6、8、10 ml 置10 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀。各取10 μl 进样，得绿原酸标准曲线:Y= 26 347 606．481 5X- 76 704．900 0(R2=0．999 0)，线性区间为0．021 6～0．108 0 mg/ml。分别精密移取木犀草苷对照品溶液1、2、3、4、5 ml 置10 ml 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀。各取10 μl 进样，得木犀草苷标准曲线:Y=28 566 947．115 4X+22．150 0(R2=0．999 1)，线性区间为0．000 416～0．002 080 mg/ml。

2.6 仪器精密度考察试验

各取绿原酸和木犀草苷对照溶液10 μl，分别连续进样，绿原酸进样5 次、木犀草苷进样6 次。绿原酸对照品峰面积为1 545 705、1 595 679、1 591 407、1 591 079、1 599 343，RSD为1．39%;木犀草苷对照品峰面积为59 965、60 026、60 136、59 872、60 042、60 338，RSD为0．267%，结果表示精密度均良好。

2.7 重复性试验

各取绿原酸和木犀草苷对照溶液样品10 μl，分别连续进样6 次。绿原酸对照品峰面积为1 892 130、1 891 252、1 883 133、1 884 348、1 874 805、1 878 004，RSD为0．368%;木犀草苷峰面积为31 823、31 789、31 944、31 825、32 045、32 313，RSD为0．632%，结果表明重复性良好。

2.8 重现性试验

精密称取同一批金银花粉末6 份，每份0．5 g，按供试品方法分别制备供试品溶液6 份，分别进样10 μl。得绿原酸峰面积为1 585 941、1 600 474、1 649 284、1 628 870、1 505 830、1 513 773，RSD 为3．746%;得木犀草苷峰面积为33 561、33 732、35 696、35 559、35 526、35 908，RSD为3．018%。

2.9 加样回收率试验

精密称取同一批金银花粉末3 份，每份0．5 g，按供试品方法分别制备供试品溶液分别进样10 μl。结果表明，该方法具有良好的回收率，见表1。

表1 绿原酸和木犀草苷加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery test on chlorogenic acid and luteoloside

2.10 稳定性试验

2．10．1 绿原酸稳定性试验:精密移取绿原酸对照品溶液2、10 ml，分别加70%的甲醇至10 ml，摇匀，绿原酸在0、6、12、24、48 h 进样。低浓度(0．019 8 mg/ml)的绿原酸在各时间段的峰面积为610 754．5、621 798、628 247、625 951、671 158;高浓度(0．099 0 mg/ml)的绿原酸在各时间段的峰面积为3 105 036、3 180 842、3 242 950、3 323 039、3 861 145。结果表明，绿原酸对照品溶液在24 h 内稳定，绿原酸峰面积的RSD分别为1．25%和2．88%;绿原酸在48 h 内不稳定。

2．10．2 木犀草苷稳定性试验:精密移取木犀草苷对照品溶液1、5 ml 加70%甲醇至10 ml，摇匀，在0、6、12、24、48 h、6 d进样。低浓度(0．000 416 mg/ml)的木犀草苷在各时间段的峰面积为11 905．5、12 114、12 105、11 967、12 696、13 964;高浓度(0．002 080 mg/ml)木犀草苷在各时间段的峰面积为59 918．5、60 392、61 026、60 547、68 433、70 342。结果表明，木犀草苷对照品溶液在48 h 内稳定，木犀草苷峰面积的RSD分别为2．62%和0．755%;木犀草苷在6 d 内不稳定。

2.11 样品含量测定

不同提取方法的含量测定结果见表2。比较4 种提取样品中绿原酸和木犀草苷含量的方法，考虑提取方法操作的方便性和经济性，本实验选择提取方法为“70%甲醇50 ml，超声处理30 min”。

3 讨论

3.1 检测波长的适应性

对绿原酸与木犀草苷紫外扫描图可知，绿原酸的检测波长范围在300～340 nm，最佳检测波长为326 nm，与《中华人民共和国药典》推荐的检测波长327 nm 基本一致［1］;木犀草苷的检测波长范围在245～270 nm/330～360 nm，最佳检测波长为350 nm。两者共同吸收的波长范围还是较宽，两者重叠波长在300～340 nm，与黄海侠的结论基本一致，与《中华人民共和国药典》推荐的检测波长350 nm 和张元元实验结果有些出入［2-3］。同时测定绿原酸与木犀草苷时，可根据具体情况选择最佳波长。

表2 不同提取方法样品中绿原酸和木犀草苷的含量Tab 2 Contents of chlorogenic acid and luteoloside extracted by different extraction method

3.2 最佳色谱条件的选择

绿原酸与木犀草苷极性相差大，且样品中两者含量差别也大，一般等度洗脱不能将两者分离，须选择最佳色谱条件，方可取得满意的提取效果。经考察，最终确定HPLC 法测定金银花中2 种成分含量的最佳色谱条件即流动相:0．5%冰乙酸-乙腈，线性梯度洗脱:0～20 min(90∶10～78∶22)，20～35 min(78∶22～76∶24)，35～37 min(76∶24～65∶35)，37～40 min(65∶35～90∶10);流速:1．0 ml/min;检测波长:绿原酸326 nm，木犀草苷350 nm;柱温:30 ℃;色谱柱:依利特Hypersil ODS2(4．6 mm×250 mm，5 μm);进样量:10 μl。在此色谱条件下2 种成分完全分离。

3.3 金银花有效成分提取方法

比较了不同提取方法的提取率，最优的提取方法为精密称取金银花粉末0．5 g，置于锥形瓶中，加入70%甲醇50 ml，称定质量，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过［4］。测得的绿原酸和木犀草苷的含量分别为3．416%、0．124%。该方法提取时间短，方法简、效果好。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典： 一部［S］．2010 年版．北京:中国医药科技出版社，2010:595-596．

［2］ 王海侠，汪玮鑫，时维静，等．金银花中绿原酸和木犀草苷的同时提取及测定研究［J］．安微科技学院学报，2011，25(5):37-41．

［3］ 张元元，李进，陈涛，等．高效液相色谱法同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量［J］．天津中医药大学学报，2011，30(2):107-109．

［4］ 许哲，朱国庆．金银花提取工艺研究［J］．黑龙江医药，2010，23(3):396-398．