补骨脂盐炙前后含药血清对人成骨细胞的影响

高倩倩， 颜翠萍， 翁泽斌， 赵根华， 陈志鹏， 蔡宝昌， 李伟东*

（1.南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏南京210046，2.南京中医药大学药学院，江苏南京210046，3.济川药业集团股份有限公司，江苏泰州225400）

补骨脂盐炙前后含药血清对人成骨细胞的影响

高倩倩1，2， 颜翠萍3， 翁泽斌1，2， 赵根华1，2， 陈志鹏1，2， 蔡宝昌1，2， 李伟东1，2*

（1.南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏南京210046，2.南京中医药大学药学院，江苏南京210046，3.济川药业集团股份有限公司，江苏泰州225400）

目的研究补骨脂盐炙前后含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响。方法采用从绝经后妇女股骨松质骨分离得到的成骨细胞，利用补骨脂生品和盐炙品含药血清干预，采用MTT法、碱性磷酸酶活性测定法、茜素红染色法研究其对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。结果补骨脂生品和盐炙品含药血清均能促进人成骨细胞的增殖，提高碱性磷酸酶的活性，且血清体积分数为20%时，补骨脂盐炙品含药血清对成骨细胞增殖、分化的促进作用显著优于生品（P＜0.01）；同时，补骨脂生品和盐炙品含药血清均能促进成骨细胞矿化的作用，且盐炙品要优于生品。结论补骨脂生品和盐炙品含药血清均具有良好的促进人成骨细胞增殖、分化和矿化的作用，其中盐炙品的作用显著优于生品。

补骨脂；盐炙；成骨细胞；骨质疏松症

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，性温味辛，具有补肾助阳，温中止泻，纳气平喘的功效［1］。现代药理研究表明，补骨脂具有明显的抗骨质疏松活性。近年来研究表明［2］，补骨脂水煎剂可改善去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢指标和血清细胞因子水平。补骨脂炮制品主要有生品和盐炙品两种，药物经盐炙后能增强其补肾健骨的作用。本研究采用细胞培养技术和中药血清药理学方法，探讨补骨脂盐炙前后含药血清对体外培养人成骨细胞增殖、分化和矿化的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ZesisAxion A1倒置显微镜（德国Zesi公司）；CO2培养箱（德国MEMMERT INE600公司）；低速离心机 （湘仪离心机仪器公司）；Bio-Rad Model 550型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药物与试剂 补骨脂生品 （批号110711，南京海源中药饮片有限公司），经南京中医药大学陈建伟教授鉴定，为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实。α-MEM培养基 （批号SH30265，美国Hy-Clone公司）；胎牛血清 （批号1527494，美国Gibco公司）；青/链霉素溶液 （批号15140-122，美国Gibco公司）；胰蛋白酶 （批号25200-056，美国 Gibco公司）；MTT（批号BS030A，中国Biosharp公司）；碱性磷酸酶试剂盒（批号P0321，碧云天生物技术研究所）；细胞钙茜素红染色试剂盒 （批号GMS80046.3，上海杰美基因医药科技有限公司）。

1.3 动物 SPF级雌性SD大鼠30只，体质量250～300 g，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（浙）2014-0001。饲养条件：室温（23±2）℃，相对湿度 （60±5）%，12 h光照，标准营养颗粒饲料喂养，自由饮水。

2 实验方法

2.1 样品制备

2.1.1 盐补骨脂的制备 根据 《中国药典》2010年版一部附录ⅡD盐炙法自制。其炮制工艺为取补骨脂生品，加盐水拌匀，闷润透，置炒制容器内，以文火加热，炒至有香气溢出，表面焦黄时，取出，放凉 （注：每100 kg补骨脂用食盐2 kg）。

2.1.2 补骨脂水煎液的制备 取补骨脂生品和盐炙品各50 g，置于砂锅之中，精密加入水500 mL，武火煎煮至沸，文火煎煮20 min，煎煮2次，过滤，合并2次煎煮滤液，使用旋转蒸发仪浓缩至0.2 g/mL，备用。

2.2 含药血清的制备 30只大鼠随机分为3组：空白组、补骨脂组和盐补骨脂组。每天分别灌胃给补骨脂生品以及盐炙品的水提液 （2 mL/200 g），空白组口服给生理盐水。连续给药7 d，第7天灌胃给药1 h后，所有大鼠，心脏插管取血，室温下静置1 h，3 600 r/min离心10 min，取血清。所收集的血清于56℃灭活30 min，过滤除菌后保存于-80℃，备用。

2.3 成骨细胞的培养［3-4］绝经后妇女松质骨组织由江苏省中医院骨科提供，无菌条件取出绝经后妇女股骨松质骨组织 （术前经患者同意，并得到南京中医药大学伦理委员会的批准），PBS冲洗3遍。剪成1 mm3左右小粒。用PBS反复冲洗至小骨粒发白，移入培养皿 （瓶）中，加入0.25%胰蛋白酶消化1 h，血清终止消化，弃上清。加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液培养，静置数天，待细胞从骨粒边长出后换培养液并弃骨粒。2～3 d换液一次，细胞汇合铺满细胞瓶后，使用胰蛋白酶消化，1∶3传代培养，实验均采用P3代细胞。

2.4 细胞增殖率测定［5-6］P3代细胞按104个/孔接种于96孔培养板，每孔100μL，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，弃去原培养液，换无血清培养液，饥饿细胞24 h，弃去无血清培养液，向96孔板中加入各组不同体积分数含药血清培养液 （5%，10%，20%）和空白血清培养液，以含10%胎牛血清的培养液为空白对照，每药重复6个孔。分别于48 h后，弃去培养液，加入MTT液（5 mg/mL）20μL/孔，37℃孵育4 h，弃去孔内上清液，加入150μL DMSO/孔，摇床震荡10 min，用酶标仪选择在490 nm处，测定各孔吸光度值。细胞增殖率的计算如下：

增殖率%=［（OD样品-OD空白）/（OD对照-OD空白）-1］×100%

2.5 碱性磷酸酶活性测定［7］P3代细胞按105个/孔接种于24孔板中，每孔400μL，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，弃去原培养液，换无血清培养液，饥饿细胞24 h，弃去无血清培养液，向24孔板中加入各组不同体积分数含药血清培养液 （5%，10%，20%）和空白血清培养液，以含10%胎牛血清的培养液为对照，每药重复6个孔，每孔400μL，培养72 h后，取含药培养液20μL，按照碱性磷酸酶试剂盒操作方法，显色后在405 nm波长下测定各孔吸光度值，根据试剂盒说明分别计算碱性磷酸酶活性。

2.6 矿化结节钙茜素红染色［8］P3代细胞按2× 105个/孔接种于6孔板中，每孔2.0 mL，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h，弃去原培养液，换无血清培养液，饥饿细胞24 h，弃去无血清培养液，向6孔板中加入各组不同体积分数含药血清培养液 （5%，10%，20%）和空白血清培养液，以含10%胎牛血清的培养液为对照，每药重复3个孔，每孔2.0 mL，培养14 d后，按照细胞钙茜素红染色试剂盒操作方法，显色后在倒置显微镜下拍片照相记录。

2.7 统计学处理 所有实验数据均以x±s表示，统计方法采用单因素方差分析 （ANOVA），用SPSS 16.0统计学软件进行统计处理，以P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为有显著性差异，P＜0.001为有极显著性差异。

3 实验结果

3.1 不同时期细胞显微镜下形态 刚取出的成骨细胞呈球形，悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁，24 h存活细胞已完全贴壁展开 （图1a）。展开后的细胞形态不规则，多呈三角形、多角形，有较多突起，单核呈卵圆形，1～3个核仁。生长期细胞突起相互联接，汇合时细胞呈铺石状，并可重叠生长（图1b）。重叠生长的细胞逐渐形成细胞小结，随后胶原堆积及钙盐沉积，最后形成不透光矿化结节，茜素红染色后呈现桔红色 （图1c）。

图1 人成骨细胞的形态Fig.1 Phase-contrastm icroscopic appearance of human osteoblasts

3.2 盐炙对补骨脂含药血清干预人成骨细胞增殖活性的影响 MTT法分析补骨脂不同炮制品的含药血清对人成骨细胞增殖活性的影响，表1显示，补骨脂的生品及盐炙品的含药血清均具有促进成骨细胞增殖的作用，且血清体积分数为20%时，补骨脂盐炙品含药血清促进成骨细胞增殖的作用显著优于生品含药血清 （P＜0.01），因此补骨脂生品和盐炙品含药血清促进成骨细胞增殖作用最佳体积分数为20%。实验结果表明，盐炙能够增强补骨脂含药血清促进成骨细胞增殖的作用。

表1 补骨脂不同炮制品含药血清对成骨细胞增殖活性的影响 (x±s,n=4)Tab.1 Effects of the serum containing processed Buguzhion osteoblasts proliferation after treatment in 48 h(x±s,n=4)

3.3 盐炙对补骨脂含药血清的成骨细胞增殖活性的影响

3.3.1 ALP活性标准曲线的建立 以酶活性（U/L）为横坐标 （x），吸光度值为纵坐标 （y），建立回归方程，得到回归方程为y=0.094 5x-0.013 4（μ=0.999 5）。

3.3.2 盐炙对补骨脂含药血清的成骨细胞分化活性的影响 ALP活性测定法分析补骨脂不同炮制品的含药血清对成骨细胞分化活性的影响，表2显示，补骨脂的生品及盐炙品的含药血清均具有促进成骨细胞分化的作用，且血清体积分数为10%、20%时，补骨脂盐炙品含药血清促进成骨细胞分化的作用显著优于生品含药血清 （P＜0.01），补骨脂生品和盐炙品含药血清促进成骨细胞分化作用最佳体积分数为20% （P＜0.001）。实验结果表明，盐炙能够增强补骨脂含药血清的促进成骨细胞分化的作用。

3.4 盐炙对补骨脂含药血清的成骨细胞矿化活性的影响 人成骨细胞加入空白血清和含药血清后继续培养，在第14天进行茜素红染色，呈现大小形态不一的桔红色阳性结节 （图2），每孔随机选择6个视野，低倍镜下对6个视野的矿化结节计数，表3所示为补骨脂不同炮制品含药血清处理组成骨细胞矿化结节数量。

表2 补骨脂不同炮制品含药血清对人成骨细胞分化活性的影响 (x±s,n=4)Tab.2 Effects of the serum containing processed Buguzhi on human osteoblasts differentiation(x±s,n=4)

图2 人成骨细胞钙茜素红染色图 (x 10)Fig.2 Representative photograph of m ineralization nodu les staining in human osteoblast treated w ith serum containing processed Buguzhi(x 10)

表3 补骨脂不同炮制品含药血清对人成骨细胞矿化结节数量的影响 (x±s,n=6)Tab.3 Effects of the serum containing p rocessed Buguzhi on human osteoblasts m ineralization nodu les(x± s,n=6)

结果表明，与空白对照组相比，空白血清对成骨细胞矿化结节的形成无显著的作用，而补骨脂生品及盐炙品含药血清具有促进成骨细胞矿化结节形成的作用，且补骨脂盐炙品的作用要优于生品。

4 讨论

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，由成骨细胞介导的骨形成，主要由两个重要的环节组成。首先，成骨细胞分化的骨标记基因的表达 （I型胶原蛋白、骨调素、骨唾液酸蛋白、骨钙素），第二就是细胞基质中由Ca、P沉积所形成的细胞外基质矿化［9］。成骨细胞在骨形成过程中要经历细胞增殖、细胞外基质成熟、矿化和细胞凋亡4个阶段，这4个阶段均需借助精细的调控，以最终完成正常的骨形成［10］。当成骨细胞数量不足或活性较低时，就不能维持骨的完整性和功能发挥所必需的骨形成和骨吸收之间的动态平衡，从而使得骨形成大于骨吸收，久之便造成骨质疏松［11-13］。在正常骨重建的过程中，无论是增加成骨细胞增殖或诱导成骨细胞分化都可增强骨形成。成骨细胞的功能是维持骨形成和正常骨质密度的关键因素。因此，刺激成骨细胞的增殖，分化和矿化能促进骨形成，从而防止骨量丢失，降低骨折发生率。因此，防治骨质疏松的关键之一是提高成骨细胞增殖、分化的能力［14-15］，而促进成骨细胞功能的中药是预防骨质疏松症的药物之一。

本研究采用绝经后妇女分离得到的成骨细胞，利用补骨脂生品和盐炙品含药血清干预成骨细胞，干预48 h后，成骨细胞增殖率显著增加，且血清体积分数为20%时，盐炙品显著优于生品，说明补骨脂能够促进成骨细胞的增殖。碱性磷酸酶［10］是成骨细胞分化早期的标志，在本研究中含药血清干预细胞72 h后，成骨细胞碱性磷酸酶活性显著提高，且血清体积分数为20%时，盐炙品显著优于生品。说明补骨脂能够促进成骨细胞的分化。矿化是成骨细胞在骨形成时期所必须经历的阶段，本研究中不同炮制品含药血清干预成骨细胞14 d后，所形成的矿化结节显著增加，且盐炙品要优于生品。

本实验研究盐炙对补骨脂体外药效的影响，采用体外成骨细胞模型，采用MTT法，ALP活性测定法，茜素红染色法，研究补骨脂含药血清对于成骨细胞活性的影响，结果显示补骨脂的含药血清具有成骨细胞活性，能够促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，盐炙增强了补骨脂含药血清促进成骨细胞增殖、分化和矿化的活性。说明了补骨脂盐炙入药的合理性和必要性，为中药炮制机理研究奠定基础，为中医临床用药提供新的研究思路。

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Effect of serum containing raw and salt-processed Buguzhion human osteoblasts

GAO Qian-qian1，2， YAN Cui-ping3， WENG Ze-bin1，2， ZHAO Gen-hua1，2， CHEN Zhi-peng1，2，CAIBao-chang1，2， LIWei-dong1，2*
（1.Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Fngineering Center of State Ministry of Fducation for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210046，China；2.Pharmacy College of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China；3.Jiangsu Jumpcan Pharmaceutical Group Co.，Ltd，Taizhou 225400，China）

AIMTo investigate the effectof serum containing raw and salt-processed Buguzhi（Psoralea corylifolia L.）on the proliferation，differentiation，and mineralization of human osteoblasts.METHODSOsteogenic cells were obtained from the femur in postmenopausalwomen.Serum containing raw or salt-processed Buguzhiwas incubated with human osteoblasts.Their effectswere determined by MTTmethod，including the activity of alkaline phosphatase and alizarin red staining by using commercial ELISA kits.RESULTSSerum containing raw or saltprocessed Buguzhi promoted human osteoblast proliferation and ALP activity compared with the control.When the concentration of serum reached 20%，the effects of salt-processed Buguzhion the proliferation，differentiation of osteoblast significantly exceeded thatof raw Buguzhi（P＜0.01）.CONCLUSIONSerum containing raw and saltprocessed Buguzhi can increase proliferation，differentiation，and mineralization activities in human osteoblast and the salt-processed Buguzhi is significantly better than the raw one.

Buguzhi（Psoralea corylifolia L.）；salt processing；osteoblast；osteoporosis

R283；R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1402-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.003

2014-11-15

江苏省高校自然科学基金重点项目 （11KJA360001）；江苏省中药学优势学科开放课题 （2001ZYX2-010）

高倩倩 （1990—），女，硕士生，主要从事中药炮制机理研究。Tel：18351895575，E-mail：18351895575@163.com

*通信作者：李伟东 （1969—），男，博士，研究员，硕士生导师，主要从事中药炮制机理研究。Tel：（025）86798281，E-mail：liweidong0801@163.com