两种阿魏挥发油急性毒性及其化学成分的比较研究

罗 茜， 马桂芝， 单 萌， 王 娟， 于富生， 滕 亮， 王长虹

（1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐830011；2.新疆华圣元医药科技有限公司，新疆 乌鲁木齐830011；3.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆乌鲁木齐830011；4.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海201203）

两种阿魏挥发油急性毒性及其化学成分的比较研究

罗 茜1， 马桂芝1， 单 萌1， 王 娟1， 于富生2， 滕 亮3，4*， 王长虹4*

（1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐830011；2.新疆华圣元医药科技有限公司，新疆 乌鲁木齐830011；3.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆乌鲁木齐830011；4.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海201203）

目的对两种阿魏挥发油的急性毒性和化学成分进行比较研究。方法将两种阿魏挥发油系列浓度乳剂分别给予小鼠一次性灌胃，观察给药后小鼠的毒性反应和死亡情况。以小鼠死亡率为指标，采用Bliss法测定两种挥发油对小鼠的半数致死量，比较两种阿魏挥发油的毒性。采用GC-MS对两种阿魏挥发油化学成分进行分析。结果阿勒泰多伞阿魏挥发油LD50=10 240 mg/kg；五彩阿魏挥发油LD50=491.61 mg/kg，试验动物出现呼吸系统、神经系统中毒症状。五彩阿魏挥发油中共鉴定出22种化合物，硫化合物含有量超过挥发油总量的60%；阿勒泰多伞阿魏挥发油中共鉴定出50种化合物，未检出含硫化合物。结论阿勒泰多伞阿魏挥发油急性毒性较小，中毒症状较轻。两种阿魏化学成分种类及含有量差异较大，可能是其毒性差异的物质基础。

阿勒泰多伞阿魏；五彩阿魏；挥发油；化学成分；急性毒性

阿魏为伞形科植物阿魏Ferula assafoetida L.、新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen、宽叶阿魏Ferula conocaula Eug.的树脂，对血液循环、神经、免疫系统都有影响，具有消积、杀虫、祛湿、止痛之功效，可用于治疗心腹冷痛、慢性肠胃炎、风湿性关节炎。阿魏主要生长于多沙地带，分布于前苏联中亚细亚地区及伊朗、阿富汗。树脂外表暗黄色或黑棕色，贮藏日久则变为红棕色，新的破折面为乳白色或浅黄棕色，或红棕色交错，通称为 “五彩阿魏”。新疆阿魏、宽叶阿魏则主要分布于新疆［1-5］。

历版 《中华人民共和国药典》都收载了新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen和阜康阿魏Ferula fukanensis K. M.Shen［6］。近年来由于开荒造田、筑路、水源断流、干旱、滥采滥挖等原因导致阿魏生长面积大幅度缩小，已无商品药材可提供。《中国珍稀濒危保护植物名录》中新疆阿魏被列为三级重点保护濒危植物，国务院发布的 《野生药材资源保护管理条例》中，新疆阿魏被列为二级保护重要野生药材物种。在药用阿魏资源匮乏的情况下，寻找药典收载阿魏的替代药材迫在眉睫。

在国产阿魏的产地新疆，除了具有蒜臭样气味的臭阿魏，还大量存在着不具有蒜臭味的香阿魏，并在民间习用多年。香阿魏为伞形科植物多伞阿魏Ferula ferulaeoidis（Steud.）Korov.的树脂或根，在维吾尔、哈萨克等民族民间中用于治疗心腹冷痛、腹部肿块、慢性肠胃炎、虫积、肉积、慢性支气管炎及风湿性关节炎等症，调研发现其产量及价格与药典收载阿魏相比均有很大的优势，对其深入研究具有潜在的环境价值与经济意义。

课题组在前期优选了新疆阿魏［7］、新疆奇台产多伞阿魏［8］、新疆阿勒泰产多伞阿魏与五彩阿魏挥发油的提取工艺 （新疆阿勒泰产多伞阿魏的提取工艺优选与五彩阿魏挥发油的提取工艺优选将另文进行报道），结果发现4种阿魏挥发油外观与理化性质差别较大。本实验对阿勒泰多伞阿魏 （香阿魏）和五彩阿魏 （臭阿魏）挥发油的急性毒性作比较，并将其化学成分进行比较分析，为后续阿魏药材的替代研究奠定试验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 气质联用仪（Agilent 7890 A-5975C型，美国）；电子天平 （BS110S，北京赛多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）；智能恒温电热套（DRT-SX型，郑州长城科工贸有限公司）；挥发油提取器 （江苏鉴湖玻璃仪器厂）。1.2 试剂与药材 吐温80（天津市福晨化学试剂厂，批号20110411）；大豆油 （中粮食品营销有限公司，批号20130522）；丙酮 （天津永晟精细化工有限公司，20111020）；无水硫酸钠 （天津市天达净化材料精细化工厂，050810）；阿勒泰多伞阿魏 （Ferula ferulaeoidis（Steud.）Korov.，批号20140327，购于乌鲁木齐华泰辉煌商贸有限公司，由新疆华圣元医药科技有限公司于富生主任药师鉴定为多伞阿魏的树脂）；五彩阿魏 （Ferula assafoetida L.），批号20120508，购于安徽亳州蕉城区丰水源刘庄，由新疆华圣元医药科技有限公司于富生主任药师鉴定为五彩阿魏的树脂）。

1.3 实验动物 昆明种小鼠 （KM小鼠），体质量为18～22 g，雌雄各半，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号SCXK（新）2011-0004。

2 方法与结果

2.1 两种阿魏挥发油的提取

2.1.1 五彩阿魏挥发油的提取 称取五彩阿魏50 g，加入6.5倍水，提取5 h，冷却，收集挥发油，采用无水硫酸钠干燥，即得。

2.1.2 阿勒泰多伞阿魏挥发油的提取 称取阿勒泰多伞阿魏50 g，加入14倍水，提取7 h，趁热收集挥发油，冷却，即得。

2.2 两种阿魏挥发油急性毒性试验［9］

2.2.1 两种阿魏挥发油乳剂的制备 采用湿胶法制备挥发油乳剂，以吐温80作为乳化剂，将两种阿魏挥发油分别溶于一定量大豆油中作为油相，分次加入到含有乳化剂的水相中，用力研磨使成初乳，再加水稀释至一定量，配制成所需浓度的挥发油乳剂。初乳中油、水、乳化剂的比例为4∶2∶1。

2.2.2 多伞阿魏挥发油急性毒性试验 小鼠灌胃给予含多伞阿魏挥发油的乳剂，经预试验确定其对小鼠的最大致死剂量为16 000 mg/kg，最小致死剂量为6 500 mg/kg。根据预试验结果，在正式试验中将50只KM小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半，以16 000 mg/kg为初始剂量，组间剂量比值K为0.8，按1∶0.8等比稀释法配制系列浓度多伞阿魏挥发油乳剂，各组小鼠按0.2 mL/10 g体质量一次性灌胃给药 （给药前禁食不禁水12 h），给药后连续观察14 d，详细记录各组小鼠毒性反应和死亡情况。采用Bliss软件计算半数致死量 （LD50），结果见表1。

表1 多伞阿魏挥发油急性毒性试验结果

结果多伞阿魏挥发油LD50为10 240 mg/kg，LD50的95%可信限为9 140.4～11 472 mg/kg。

2.2.3 五彩阿魏挥发油急性毒性试验 小鼠灌胃给予含五彩阿魏挥发油的乳剂，经预试验确定其对小鼠的最大致死剂量为900mg/kg，最小致死剂量为200 mg/kg。根据预试验结果，在正式试验中将KM小鼠随机分为7组，每组10只，雌雄各半。以900 mg/kg为初始剂量，组间剂量比值K为0.78，按1∶0.78等比稀释法配制系列浓度五彩阿魏挥发油乳剂。各组小鼠按0.2 mL/10 g体质量一次性灌胃给药 （禁食不禁水12 h），即刻观察给药后各组出现的中毒反应及死亡情况，连续观察14 d，详细记录各组小鼠毒性反应及死亡情况，采用Bliss软件计算半数致死量（LD50），结果见表2。

表2 五彩阿魏挥发油急性毒性试验结果

结果五彩阿魏挥发油的LD50为491.61 mg/kg，95%可信限为422.39～577.8 mg/kg。

2.3 两种阿魏挥发油化学成分GC-MS分析

2.3.1 样品制备

2.3.1.1 五彩阿魏挥发油 精密量取五彩阿魏挥发油1mL，置10mL量瓶中，丙酮定容至刻度，即得。

2.3.1.2 阿勒泰多伞阿魏挥发油 精密称取挥发油0.1 g，置10 mL量瓶中，丙酮溶解并定容至刻度，即得。

2.3.2 气相色谱质谱分析条件

2.3.2.1 气相色谱条件［10］气质联用仪（Agilent7890 A-5975C型，美国）；HP-5MS毛细管柱 （30 m×0.25 mm× 0.25μm）；载气为高纯氮气；载气体积流量为1 mL/min；进样量0.5μL；分流比30∶1；进样器250℃；检测器250℃；起始温度为60℃，保持2 min，以2℃/min的速率程序升温至120℃，保持5 Min，最后以4℃/min升温至180℃，保持5 min。

2.3.2.2 质谱条件 电离方式EI；电离能量70 eV；离子源发生器温度230℃；质量扫描范围30～350 amu。

2.3.3 气相色谱质谱分析结果

2.3.3.1 五彩阿魏挥发油 五彩阿魏挥发油的总离子流图见图1。采用面积归一化法以计算出各组分的相对含有量，经CAS数据库检索，确定了阿魏挥发油的基本化学成分，共鉴定出22种化合物，其中主要成分为 （1R）-α-蒎烯（5.06%）、1，2-二硫戊烷 （61.46%）、2，2-双 （甲硫基）-丙烷 （10.465%）、 （E）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（3.528%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯 （2.10%）、别罗勒烯 （2.34%）、对乙烯基愈创木醇 （2.771%）、α-桉叶醇 （3.291%）等，含硫化合物含有量超过挥发油总量的60%。

2.3.3.2 阿勒泰多伞阿魏挥发油 阿勒泰多伞阿魏挥发油的总离子流图见图2。采用面积归一化法以计算出各组分的相对含有量，经CAS数据库检索，确定了阿勒泰多伞阿魏挥发油的基本化学成分，共鉴定出50种化合物，其中主要成分为愈创木醇 （43.554%）、D-柠檬烯 （5.365%）、（1S-内型）-1，7，7-三甲基-二环 ［2.2.1］庚-2-醇乙酸酯（6.791%）、反 式-橙花叔 醇 （4.207%）、α-桉叶醇（6.556%）、 （2R-顺式）-2R-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氢-ππ4a，8-四甲基-2-萘甲醇 （5.053%）等。未检出多硫化合物。

图1 五彩阿魏挥发油总离子流图

图2 阿勒泰多伞阿魏挥发油总离子流图

2.3.4 两种阿魏挥发油化学成分比较 两种阿魏挥发油化学成分的比较结果见表3。

表3 两种阿魏挥发油化学成分分析结果

续表3

续表3

3 讨论

3.1 关于急性毒性试验 在预试验阶段考察了不加药物的空白乳剂对小鼠的毒性，结果表明在相同剂量与观察时间段内，小鼠灌服空白乳剂后行为活动正常，未显示出明确的急性毒性，提示制备乳剂所用的材料对小鼠健康状态基本无影响，可以应用于阿魏挥发油乳剂的制备中。

急性毒性试验结果表明两种阿魏挥发油均具有一定毒性。多伞阿魏挥发油给药后，高剂量组小鼠短期内俯卧不动，呼吸频率减慢，瞳孔缩小，对外界刺激反应能力降低，24 h左右可观察到小鼠尾部间歇性翘起，24 h后动物陆续死亡；低剂量组小鼠给药后行动缓慢，牵张反射减弱，不能站立，死亡的小鼠无明显的尾部翘起现象。五彩阿魏挥发油给药后，高剂量组小鼠1 h内即出现强直性抽搐现象，腹式呼吸明显，4 h内即可出现死亡现象；低剂量组小鼠给药后腹式呼吸明显，无明显抽搐现象。两种阿魏挥发油中毒死亡小鼠的尸解结果显示未见器官明显病变。根据毒性反应情况，提示一定剂量的阿魏挥发油对小鼠的呼吸系统、神经系统等有一定的毒性作用，并且剂量不同时，中毒反应情况不同。相较而言，阿勒泰多伞阿魏挥发油急性毒性较小，中毒症状较轻。

3.2 两种阿魏挥发油化学成分的比较 将两种阿魏挥发油化学成分分析结果进行比较研究，可以发现两种阿魏均含有蒎烯、α-水芹烯、（E）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、α-桉叶醇等化合物。五彩阿魏挥发油中含蒎烯、对乙烯基愈疮木酚、γ-桉叶醇等，并伴有多种硫化物，其中1，2-二硫戊烷约占60%以上，文献调研表明臭阿魏挥发油因含多硫化合物而具有强烈蒜样臭味［11］，而多伞阿魏挥发油GC-MS分析结果表明鉴定出的化合物中不含多硫化合物，与提取物无蒜臭气味相一致。其主要成分为单萜及倍半萜类衍生物，如愈创木醇、α-桉叶醇等，该类化合物多具有消炎抗菌及解痉镇痛作用，这有可能是多伞阿魏在民间药用的物质基础之一。多伞阿魏鉴定出的化合物成分组成及主要成分的百分含有量与文献报道的香阿魏化学成分［12-14］不完全一致，这可能与产地、采期、测试仪器的条件有关。而多伞阿魏中含有量高达43.554%的愈创木醇在五彩阿魏中未检测到，文献调研表明愈创木醇主要存在于愈创木油中，愈创木油是一种常温下为固态的精油，而在阿魏挥发油提取过程中发现，五彩阿魏常温下为液态，而阿勒泰多伞阿魏挥发油在常温下则完全为固态，因此可以初步推测愈创木醇的含有量变化可能是两种阿魏挥发油室温状态不同的主要原因。王春娟等［15］对阿魏提取物杀虫抑菌活性进行了初步研究，并以杀虫活性跟踪为指导确定了愈创木醇是其主要杀虫活性化合物，根据两种阿魏中愈创木醇含有量变化可以推测与五彩阿魏相比，阿勒泰多伞阿魏的抑菌作用应该会比较理想，课题组会通过后续研究予以确证。

3.3 急性毒性差异与化学成分差异的关联性分析 结合两种阿魏急性毒性和化学成分实验结果，推测两种阿魏化学成分种类及含有量不同是其毒性不同的主要原因。含硫化合物具有明确的蒜臭味和黏膜刺激性，与多伞阿魏相比，相同剂量情况下，推测五彩阿魏中大量的多硫化合物有可能是其毒性较大的物质基础。但是目前未见有关含硫化合物的急性毒性研究报道，会在后续研究中考虑通过提高含硫化合物含有量进行小鼠急性毒性，以验证硫化合物含有量与毒性是否相关，为进一步阐明五彩阿魏挥发油的中毒机制提供依据。

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R285.1

：B

：1001-1528（2015）05-1130-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.048

2014-08-08

乌鲁木齐市科学技术计划项目 （Y111310035）；新疆维吾尔自治区科技型中小企业技术创新基金 （201253165）；科技部科技型中小企业技术创新基金 （12C26216507308）。

罗 茜 （1989—），女，硕士生，从事中药民族药新药研究。Tel：18082890281，E-mail：250545160@qq.com

*通信作者：滕 亮 （1975—），男，博士，教授，硕士生导师，从事中药民族药新药研究。Tel：（0991）4362442，E-mail：tl750212@ 126.com王长虹 （1964—），男，博士，研究员，博士生导师，从事中药新制剂与体内过程研究。Tel：（021）51322511，E-mail：wchcxm@hotmail.com