丹参注射液对大鼠肝微粒体CYP450亚型酶体外抑制作用

叶 娜， 罗红丽， 李 容， 王春燕， 杨楸楠， 万 丽

（成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

丹参注射液对大鼠肝微粒体CYP450亚型酶体外抑制作用

叶 娜， 罗红丽， 李 容， 王春燕， 杨楸楠， 万 丽*

（成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

目的评价丹参注射液在体外对大鼠肝微粒体细胞色素P450（CYP450）亚型酶活性的影响。方法将丹参注射液分别与5种CYP450亚型酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的特异性探针底物非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬与大鼠肝微粒体进行孵育，采用UPLC-MS/MS法测定对应5种代谢产物对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷的含有量并计算其IC50。结果丹参注射液对CYP1A2、CYP3A4的IC50值均大于100μg/ML，对CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的IC50值分别是3.32、16.44、0.30 μg/ML。结论丹参注射液对CYP1A2、CYP3A4没有抑制作用，但对CYP2C19和CYP2C9分别有弱和中等抑制作用，对CYP2D6表现出强抑制作用。

细胞色素P450酶；丹参注射液；大鼠肝微粒体；抑制

细胞色素P450酶（cytochrome P450 enzyme，CYP450）是一类以铁卟啉为辅基的血红素-硫醇盐蛋白，是生物体内参与各类外源性及内源性物质代谢的主要酶系［1］，其主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4参与市面上约90%的药物代谢［2］，在决定药物清除率和生物利用度等方面起着关键重要。因此，充分了解药物对CYP亚型酶活性的作用，对于合理用药，提高药物的安全性和有效性具有重要意义；此外，在药物研发过程中，研究主要CYP酶介导的代谢特性已成为发现和筛选有效、安全的新化合物实体的必备环节［3-4］。

中药注射剂作为我国特有剂型，由于其成分复杂，主要还是通过药物代谢酶进行代谢，从而存在对代谢酶的抑制或诱导作用，发生药物相互作用，因此，对中药注射剂的体外代谢进行研究很有必要。丹参注射液为丹参提取物制成的水溶性制剂，含丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A及B等多种成分，其中以丹参素含有量较高［5］。由于其在心脑血管疾病方面的突出疗效，临床上与多种药物的连用日益增多［6-9］，但丹参注射液对CYP450酶作用的研究报道相对较少，刘高峰［10］等指出丹参注射液对家兔CYP2D6有抑制作用。前期课题组对丹参注射液进行了质量评价研究，采用HPLC法对丹参注射液主要水溶性有效成分进行定量测定，并进行了方法学考察。结果表明各成分线性关系良好，日内、日间精密度均小于5%，重复性好，精密度高，其主要有效成分丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A的含有量分别是1.329 3、0.261 2、0.075 76、0.027 09 mg/mL。试验结果符合丹参注射液每1 mL含原儿茶酸不得少于0.2 mg的标准。因此，本研究采用探针药物法就丹参注射液对大鼠肝微粒体 5种 CYP450亚型酶 （CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的影响进行探讨，以期为丹参注射液临床合理联合用药的安全性和有效性等提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters2010型高效液相色谱仪（600泵、717自动进样器、996PD紫外检测器、Waters MassLynx V4.1 Software数据处理系统）；Thermo Heraeus Fresco 17低温冷冻离心机（Thermo Scientific公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；HGC-24型氮吹仪 （北京瑞邦兴业科技有限公司）；Millipore纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂 丹参注射液 （批号1405010，安徽天洋药业有限公司）；SD大鼠肝微粒体 （20 mg/mL）购自武汉普莱特生物医药技术有限公司，于-80℃冷冻保存；NADPH发生系统（A液、B液）购自武汉普莱特生物医药技术有限公司，于-80℃冷冻保存；非那西汀（Sigma-Aldrich公司），对乙酰氨基酚（Sigma-Aldrich公司），甲苯磺丁脲（Sigma-Aldrich公司），4-羟基甲苯磺丁脲（Toronto Research Chemicals Inc公司），奥美拉唑（Sigma-Aldrich公司），5-羟基奥美拉唑（Toronto Research Chemicals Inc公司），右美沙芬（国家药品生物制品检定所），右啡烷（Toronto Research Chemicals Inc公司），N-去甲右啡烷（Toronto Research Chemicals Inc公司）；地西泮对照品购自中国食品药品检定研究院，纯度大于99.0%。甲醇、乙腈为色谱纯，购自Fisher Scientifics公司，其他化学试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 孵育体系 每个孵育体系总体积为200μL，体系包括0.1 mol的PBS缓冲液（pH=7.4）188μL，NADPH发生系统12μL（A液10μL；B液2μL），临用时冰浴上混合制得。各探针底物及对应的代谢产物、孵育浓度和时间如下［11-12］：非那西丁（对乙酰氨基酚，50μmol/L，30 min，CYP1A2）；甲苯磺丁脲 （4-羟基甲苯磺丁脲，100 μmol/L，30 min，CYP2C9）；奥美拉唑（5-羟基化奥美拉唑，20μmol/L，20 min，CYP2C19）；右美沙芬（右啡烷，150μmol/L，10 min，CYP2D6）；右美沙芬（N-去甲右啡烷，50μmol/L，10 min，CYP3A4）。

2.2 样品处理 取上述孵育体系，冰浴上加入1μL的系列质量浓度的丹参注射液 （1、10、100、1 000、10 000μg/mL）和1μL的各特异性探针底物 （空白对照样品不加丹参注射液，只加等量溶剂），在37℃水浴中预热5 min，冰浴上加入2μL的肝微粒体酶，轻轻混匀，根据不同的探针底物在37℃水浴中孵育10～30 min，加入4℃甲醇溶液（含内标地西泮20 ng/mL）1 000μL混匀终止反应，每个样品平行测定3次。实验中加入孵育体系中的药物体积控制在1%以内。

取终止反应后含内标的肝微粒体反应体系样品，旋涡振荡混匀3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液1 000μL，40℃下氮气吹干，相应的流动相100μL复溶，旋涡振荡混匀3 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液适量，进样5μL，用LC-MS/MS法测定各特异性底物对应的代谢产物的生成量。

优化各代谢物的提取方法，其中对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲用乙酸乙酯液-液萃取，5-羟基奥美拉唑、右啡烷和N-去甲右啡烷用甲醇萃取。

2.3 UPLC-MS/MS条件

2.3.1 色谱条件 对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、右啡烷和N-去甲右啡烷选用色谱条件为色谱柱为Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm× 50 mm，1.7μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水（65/35，V/V），体积流量0.2 mL/min；柱温30℃；样品室温度10℃；运行时间2 min；进样体积5μL。

5-羟基奥美拉唑色谱条件如下：Phenomenex kinetex C8色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流动相为乙腈-水梯度洗脱 （0～2.5min，35%乙腈～60%乙腈）；体积流量0.2 mL/min；柱温30℃；样品室温度10℃；运行时间2.5 min；进样体积5μL。

2.3.2 质谱条件 通过优化选择质谱参数，最终确定的5种代谢物的质谱条件结果列于表1。

表1 各代谢产物测定的质谱参数及MRM检测条件Tab.1 Mass SpectruMparameters and MRMconditions ofmetabolites

2.4 数据处理 用各模型底物的代谢物的生成速率反映微粒体孵育体系中各CYP450亚型酶的活性；设定不加丹参注射液的代谢底物的孵育体系中各同工型酶活性为100%，作为对照组；样品组代谢物生成速率相对于对照组生成速率的百分比，作为各亚型酶的剩余活性。

剩余活性百分比=（各探针底物样品代谢物生成速率/对照样品代谢物生成速率）×100%。

采用SPSS statistics 17.0数据处理软件进行数据的统计分析。对于正态分布的参数，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05时认为该组数据具有统计学意义。用Excel对数据作图，以丹参注射液质量浓度对数值为横坐标，剩余酶活性百分率为纵坐标，得到剩余酶活性百分率为50%的对应丹参注射液质量浓度即为IC50。

3 实验结果

3.1 方法学验证

3.1.1 专属性 各待测组分及内标的峰形及分离良好，具有较高的特异性。对乙酰氨基酚，4-羟基甲苯磺丁脲，5-羟基奥美拉唑，右啡烷，N-去甲右啡烷及内标地西泮的保留时间分别是1.46、1.33、2.29、1.19、1.01、1.25 min。

3.1.2 标准曲线 采用上述选定的液相、质谱条件对5种代谢物进行定量，各代谢产物质量浓度（ng/mL）为横坐标，待测物峰面积 （A s）与内标峰面积（A i）的比值（A s/A i）为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，得质量浓度与响应值的回归方程，线性范围如表2所示。

表2 各代谢物的线性范围Tab.2 Linear ranges ofmetabolites

3.1.3 精密度和准确度试验 取空白肝微粒体孵育体系，分别加入低、中、高质量浓度的不同代谢产物，样品处理同 “2.2”项下终止反应后含内标的肝微粒体反应体系样品，即再加入4℃甲醇溶液（含内标地西泮20 ng/mL）1 000μL，旋涡振荡混匀3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液1 000μL，40℃下氮气吹干，相应的流动相100 μL复溶，旋涡振荡混匀3 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液适量，进样5μL，测定批内和批间差异。结果见表3，表明低、中、高3个质量浓度的批内、批间精密度均小于15%，符合要求，精密度良好。

3.1.4 提取回收率 取空白肝微粒体孵育体系，分别加入低、中、高质量浓度的不同代谢产物（对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷），样品处理同“3.1.3”项样品处理方法，测定提取回收率。结果见表3，表明该质量浓度范围内回收率较高，准确度符合要求，测定结果准确、可信。

表3 不同探针代谢物批内、批间精密度和准确度 （x±s，n=6）Tab.3 Intra-assay precision，inter-assay precision and recovery of probemetabolites（x±s，n=6）

3.1.5 稳定性试验 取空白肝微粒体孵育体系，分别加入低、中、高质量浓度的不同代谢产物（对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷），样品处理同“3.1.3”项，分别测定于进样器中放置 （4℃）24 h和-80℃冰冻放置7 d条件下的稳定性。结果见表4，说明各代谢产物于微粒体样品中稳定性良好。

3.1.6 基质效应 取空白肝微粒体孵育体系，分别加入低、中、高质量浓度的不同代谢产物 （对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷），样品处理同“3.1.3”项样品处理方法，与相应浓度代谢产物样品结果进行比较，以两者峰面积的比值来计算基质效应。结果表明，各组分基质效应的平均值在87.98%～103.03%范围内 （表4）。

3.2 丹参注射液对大鼠CYP450酶各亚型的IC50的测定 丹参注射液对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的IC50值分别为见表5，抑制曲线见图1。实验结果可见，丹参注射液对CYP1A2，CYP3A4的IC50值＞100 μg/mL，对CYP2C9，CYP2C19和CYP2D6的IC50值分别是3.32、16.44、0.30μg/mL。

表4 不同探针代谢物的稳定性及基质效应 （x±s，n=6）Tab.4 Stability and matrix effect of probemetabolites（x±s，n=6）

表5 丹参注射液抑制大鼠CYP450酶各亚型的IC50值Tab.5 IC50values of Danshen Injection on five specific probes of CYP450

图1 丹参注射液对各5种大鼠CYP450亚酶活性的影响Fig.1 Effects of Danshen Injection on the activities of five rat cytochrome P450 enzymes

4 讨论

酶抑制作用是代谢研究的关键，是预测药物-药物相互作用和药物安全性评价的重要指标。本研究建立了较为简单快捷的分析方法，专属性强，线性范围宽，灵敏度、准确度高，满足生物样品分析方法的一般准则。

从实验结果可知，丹参注射液对CYP1A2、CYP3A4没有抑制作用，对CYP2C9具有中等抑制作用，对CYP2C19具有弱抑制作用，对CYP2D6表现出强抑制作用。文献［13-14］报道丹参的乙醇提取物主要含脂溶性成分，丹参酮类对CYP1A2、CYP3A4/5表现出相应程度的抑制作用，水溶性成分中的丹参素则是CYP2C9的中等强度抑制剂。丹参注射液主要是水溶性活性成分，因此对CYP1A2，CYP3A4几乎没有抑制作用，而对CYP2D6的强抑制作用与文献 ［10］报道结果一致。秦崇臻等［15］指出丹参多酚酸盐能显著抑制人CYP3A4酶活性，复方丹参片对大鼠CYP1A2活性具有一定的诱导作用［16］，可见，不同丹参制剂可能因为成分差异对不同CYP450的影响不同。但是，由于种属差异，人与大鼠的实验结果是否一致，还有待于下一步采用人肝微粒体或与人体合并用药等实验进行验证。

虽然体外实验证明丹参注射液对大鼠CYP450酶具有一定的抑制作用，且其主要化学成分如丹参素等蛋白结合率低［17］，再者中药复方成分复杂，所以，在临床上与经CYP2C9、CYP2C19，尤其是CYP2D6代谢的药物联合应用时应特别注意。

综上所述，本研究采用体外肝微粒体孵育体系，研究了丹参注射液对5种大鼠CYP450亚型酶的抑制作用，为预测药物-药物相互作用，临床上应用丹参注射液及含丹参成分的注射液的安全性提供了参考。

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Inhibitory effect of Danshen Injection on rats liver cytochrome P450 enzyme in vitro

YE Na， LUO Hong-li， LIRong， WANG Chun-yan， YANG Qiu-nan， WAN Li*
（School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine；Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Developmentand Utilization of ChineseMedicine Resources，Chengdu 611137，China）

cytochrome P450 enzyme；Danshen Injection；rat livermicrosome；inhibition

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0948-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.005

2014-06-19

叶 娜 （1989—），女，硕士生，从事药物分析、中药有效成分及质量标准研究。Tel：13808206512，E-mail：yena310@ 126.com

*通信作者：万 丽 （1965—），女，教授，博士生导师，从事药物分析、中药有效成分及质量标准研究。Tel：5982418713，E-mail：wanli8801@163.com

日期：2014-10-30

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20141030.1057.001.htMl

ABSTRACT：AIMTo investigate the inhibitory effect of Danshen Injection on the activities of five rat cytochrome P450 enzymes in vitro.METHODSDanshen Injection was incubated with five specific probes（phenacetin，orinase，omeprazole，dextromethorphan，and dextrorphan）belonging to five cytochrome P450 enzymes（CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4）originated froMrat liver microsome，respectively.Their fivemetabolites（including acetaminophen，4-hydroxy tolbutamide，5-hydroxy omeprazole，dextrorphan，N-demethyl dextrorphan）were analyzed by UPLC-MS/MSassay.The IC50valueswere calculated.RESULTSDanshen Injection IC50values of CYP1A2 and CYP3A4 were more than 100μg/ML，and of CYP2C9，CYP2C19 and CYP2D6 were 3.32μg/mL，16.44μg/ML，and 0.30μg/mL，respectively.CONCLUSIONThe inhibitory effects of Danshen Injection on the activities of CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6 aremedium，weak and strong，respectively，butno effecton the activities of CYP1A2 and CYP3A4.