解毒活血滋阴方免疫抑制作用有效部位的筛选研究

卞 华， 郝鹏飞， 吕 芹， 山书玲， 付卫云， 张瓅方

（1.南阳理工学院医学院，河南南阳473004；2.南阳医学高等专科学校，河南南阳473061）

解毒活血滋阴方免疫抑制作用有效部位的筛选研究

卞 华1， 郝鹏飞1， 吕 芹2， 山书玲， 付卫云1， 张瓅方1

（1.南阳理工学院医学院，河南南阳473004；2.南阳医学高等专科学校，河南南阳473061）

目的分离并筛选解毒活血滋阴方对系统性红斑狼疮免疫抑制作用的有效部位。方法制备解毒活血滋阴方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、乙醇部位的提取物。在体内研究中，采用小鼠迟发型超敏反应模型和鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素生成模型，观察解毒活血滋阴方不同提取部位对细胞免疫和体液免疫的影响；体外研究检测解毒活血滋阴方不同提取部位对ConA及LPS诱导的小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响。结果解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位能够明显减轻小鼠迟发型超敏反应小鼠耳肿胀、降低小鼠的脾指数和胸腺指数，对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用。同时解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位各剂量组均可抑制T、B淋巴细胞增殖，且呈一定剂量依赖性。结论解毒活血滋阴方治疗系统性红斑狼疮免疫抑制作用的有效部位可能是水溶性部位和乙酸乙酯部位。

解毒活血滋阴方；系统性红斑狼疮；有效部位；免疫抑制作用

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种原因未明，以多系统或器官病变和血清中出现多种自身抗体为特征的自身免疫性疾病。解毒活血滋阴方由白花蛇舌草、生地、赤芍、青蒿、山茱萸等中药组成，具有解毒活血、滋阴清热之功效，其治疗系统性红斑狼疮疗效显著，且具有较高的安全性［1-3］。但该方治疗系统性红斑狼疮的主要药效部位尚不清楚，传统的水煎煮法导致一些水不溶性成分难免会流失。本研究以药效评价为导向，通过体内、体外实验探讨解毒活血滋阴方不同提取部位对细胞免疫、体液免疫功能和脾淋巴细胞增殖的影响，筛选其免疫抑制作用的有效部位，阐明其药效物质基础。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级ICR小鼠，雌雄各半，18～22 g，6～8周龄，购自于中国科学院上海实验动物中心，许可证号为SCXK（沪）2012-0002。

1.2 药物与试剂 解毒活血滋阴方所含药物 （白花蛇舌草、生地、赤芍、青蒿、山茱萸等）由南阳理工学院附属医院提供，经黄显章副教授鉴定均符合 《中国药典》2010年版标准；醋酸地塞米松片（Dexamethasone，Dex），天津天药药业股份有限公司生产，批号110420；二硝基氟苯 （2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）、刀豆球蛋白A（ConA）、脂多糖 （LPS）、四甲基偶氮唑蓝 （MTT）均购于美国Sigma公司；胎牛血清（FCS）购于杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640、十二烷基磺酸钠（SDS）购于美国Gibco公司。

1.3 主要仪器 Biocell 2010酶联免疫检测仪（奥地利Anthos公司）；Ti-S型研究级倒置显微镜（日本Nikon公司）；Thermo 8000型CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；超净工作台（河南智诚科技发展有限公司）；Sartorius电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；冷冻干燥机 （美国Labconco公司）。

2 方法

2.1 解毒活血滋阴方不同部位的制备 将全方药材按照一定比例组合后混匀，以75%乙醇浸渍48 h，每12 h更换一次溶剂，过滤合并滤液备用；药渣分别以8倍、6倍量水煎煮两次合并浓缩后得水溶性部位；对药渣再次分别以乙醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行提取，得到乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；取乙醇浸出液，浓缩后冻干得干燥粉末，加入水混悬后分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，依次分别得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，分别与上述相应提取液合并；而最终所剩即为乙醇部位。

2.2 迟发型超敏（DTH）反应测定实验 取80只ICR小鼠，按体质量分层随机分出10只作为空白对照组，其余小鼠参照相关实验方法［4］建立DTH小鼠模型：实验开始第1天和第2天在小鼠腹部固定部位脱毛，面积约3 cm2，于去毛部位涂0.5%DNFB（以丙酮-橄榄油4∶1的比例配置）40μL致敏，第7天于左耳内外侧涂0.3%DNFB20μL激发。按体质量随机将造模小鼠分为7组：模型组、Dex组（1.5 mg/kg）、水溶性部位组（966 mg/kg）、乙醚部位组（59 mg/kg）、乙酸乙酯部位组（188 mg/kg）、正丁醇部位组（22 mg/kg）、乙醇部位组 （321 mg/kg）。自致敏前2 d开始，按上述剂量每日灌胃实验药物0.2 mL/10 g，空白对照组、模型对照组灌胃等量蒸馏水，1次/d，连续8 d。激发48 h后颈椎脱臼法处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器在相同部位取直径8 mm耳片，以游标卡尺测量厚度并以分析天平称定质量，同时取小鼠胸腺及脾脏称定质量。以左右耳片厚度、质量之差为肿胀度；以每10 g小鼠的脾质量和胸腺质量作为脾指数和胸腺指数脾。脾 （胸腺）指数=［脾 （胸腺）质量（mg）/体质量（g）］×10。

2.3 血清溶血素测定［5］取70只ICR小鼠，按体质量随机分成7组：模型组、Dex组 （1.5 mg/kg）、水溶性部位组（966 mg/kg）、乙醚部位组（59 mg/kg）、乙酸乙酯部位组（188 mg/kg）、正丁醇部位组 （22 mg/kg）、乙醇部位组 （321 mg/kg）。按上述剂量每日灌胃实验药物0.2 ML/ 10 g，模型组灌胃等量蒸馏水，1次/d，连续给药9 d。各组小鼠在给药的第3天腹腔注射5%的鸡红细胞生理盐水混悬液0.2 mL进行免疫。于免疫后第7天，末次给药2 h后，小鼠眼球后静脉采血制备血清，用生理盐水1∶100稀释后，取1 mL稀释的血清与5%的鸡红细胞混悬液0.5mL、10%补体（豚鼠血清）0.5 mL混匀，在37℃恒温箱中温育30 min，在冰水中中止反应，2 000 r/min离心10 min，取上清液加入 96孔培养板中，每孔200μL，于540 nm处比色，另设不加血清的对照管，以空白管调 “0”点，测各管的吸光度，以间接判断血清中溶血素含有量。

2.4 脾细胞悬液的制备 将处死的小鼠放入75%乙醇中浸泡消毒1 min，无菌条件下取脾脏并去掉被膜，于200目筛网上轻捻脾组织，使细胞经筛网过滤至离心管中，离心 （1 500 r/min，10 min）后弃上清。用红细胞裂解液除去红细胞，用PBS冲洗2～4次。最后加入10%FCS-RPMI-1640培养液调节小鼠脾淋巴细胞为3×106个/ML备用。

2.5 T、B淋巴细胞增殖活性分析［6］分别检测ConA刺激的T淋巴细胞增殖和LPS刺激的B淋巴细胞增殖。将上述脾细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μL。实验分组如下：空白本底组 （只加RPMI-1640培养基），对照组 （加入终质量浓度为5μg/mL的ConA或10μg/mL的LPS）、不同质量浓度解毒活血滋阴方各部位提取物干预下的实验组（分别加入终质量浓度为5、15、25、35μg/mL的各部位提取物）、Dex组 （加入Dex，终浓度同上），每组设10个复孔。将培养板于37℃，5% CO2温箱中培养48 h。之后每孔分别加入10μL MTT溶液再继续培养4 h，然后加入100μL/孔酸化的SDS，震荡3 min，温箱培养3 h。室温20℃用酶标仪于波长490 nm处测吸光度 （A值），计算T、B淋巴细胞的抑制率。抑制率=［（对照组A均值-实验组A均值）/（对照组A均值-空白本底组A均值）］ ×100%。

2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差 （x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 解毒活血滋阴方不同提取部位的得率 由公式计算解毒活血滋阴方各提取部位的得率：得率%=（干燥粉末质量/全方药材质量）×100%。结果显示：水溶性部位为6.23%，乙醚部位为0.38%，乙酸乙酯部位为1.21%，正丁醇部位为0.14%，乙醇部位为2.07%。

3.2 解毒活血滋阴方不同提取部位对DTH小鼠耳壳肿胀度的影响 与空白组比较，DTH模型组耳壳增重和耳壳增厚显著增加 （P＜0.01）。与模型组比较，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位组均能明显抑制小鼠耳壳的肿胀 （P＜0.01）。见表1。

表1 解毒活血滋阴方不同提取部位对DTH小鼠耳壳肿胀度的影响 （x±s，n=10）Tab.1 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on auricle swelling in DTH Mice（x±s，n=10）

3.3 解毒活血滋阴方不同提取部位对DTH小鼠脾和胸腺指数的影响 与空白对照组比较，DTH模型组脾和胸腺指数均明显升高 （P＜0.01）。与模型组比较，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位组均可明显降低小鼠免疫器官的脏器指数（P＜0.05，P＜0.01），同时解毒活血滋阴方乙醇部位组亦能降低小鼠脾腺指数 （P＜0.05）。见表2。

表2 解毒活血滋阴方不同提取部位对DTH小鼠脾和胸腺指数的影响 （x±s，n=10）Tab.2 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on thymus index and sp leen index in DTH Mice（x ±s，n=10）

3.4 解毒活血滋阴方不同提取部位对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素水平的影响 解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位组对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用，可减少小鼠血清中抗体的水平，与模型组比较差异具有显著性（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 解毒活血滋阴方不同提取部位对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素的影响 （x±s，n=10）Tab.3 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on the level of hemolysin induced by fow l erythrocyte immunization in serum（x±s，n=10）

3.5 解毒活血滋阴方不同提取部位对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响 如图1、图2所示，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位各剂量组对ConA诱导的T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B淋巴细胞增殖呈现明显的抑制作用，与同组低质量浓度5μg/mL比较，15～35μg/mL抑制率差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01），其中质量浓度达到15 μg/mL时，乙酸乙酯部位组对T淋巴细胞增殖的抑制效应、水溶性部位组对B淋巴细胞增殖的抑制效应甚至高于Dex阳性对照组 （P＜0.05）。同时，质量浓度为25～35μg/ML乙醇部位组抑制率明显高于低质量浓度5μg/mL（P＜0.05）。

图1 解毒活血滋阴方不同提取部位对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响 （x±s，n=10）Fig.1 Effects of d ifferent extract fractions of JDHXZYF on ConA-induced T lyMphocyte proliferation（x±s，n=10）

图2 解毒活血滋阴方不同提取部位对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响 （x±s，n=10）Fig.2 Effects of d ifferent extract fractions of JDHXZYF on LPS-induced B lymphocyte proliferation（x±s，n=10）

4 讨论

系统性红斑狼疮 （SLE）的发生与遗传、环境、感染、性激素等有关，其大部分临床表现都是由致病性抗体、免疫复合物和T细胞所致，免疫系统功能失调是SLE的主要发病机制［7-8］。目前临床上常用的免疫抑制剂如环磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮质激素等在治疗SLE中发挥着重要作用，但这些药物存在选择性不强、毒副作用大等缺点［9］。因此，研究开发治疗SLE的新型免疫抑制剂是目前亟待解决的问题。中药解毒活血滋阴方是治疗SLE的有效方剂，且具有较高的安全性。本研究将解毒活血滋阴方全方药材分别采用有机性和水性溶剂进行提取，并建立不同部位研究体系，以药效学方法筛选其治疗SLE的免疫抑制活性部位，为后续解毒活血滋阴方针对免疫活性调节的药效理论、药效机制研究及开发新药奠定基础。

DTH是由效应T细胞介导，以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的炎症反应，与效应T细胞及其产生的细胞因子或细胞毒性介质有关，其反应强弱与机体T细胞免疫功能相一致。DNFB所致小鼠DTH是典型的Ⅳ型超敏反应实验模型，作为DTH模型被广泛用于药物评价研究［10］。本研究结果表明，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位明显减轻DTH模型小鼠耳肿胀度，提示解毒活血滋阴方能抑制效应T细胞而减轻炎症反应。免疫器官 （胸腺、脾）不仅是淋巴细胞分化成熟的场所，也是产生特异性免疫应答的场所，其质量升高或降低往往意味着机体淋巴细胞增殖的强弱，直接体现了免疫应答功能。本研究表明，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位明显降低DTH模型小鼠胸腺指数和脾指数，从而证实了解毒活血滋阴方能够抑制小鼠体内淋巴细胞增殖。在体外解毒活血滋阴方不同提取部位干预T淋巴细胞增殖的实验结果显示，不同剂量解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位对ConA诱导的T淋巴细胞增殖呈现明显的抑制作用，且乙酸乙酯部位高剂量（达到15μg/mL以上）抑制效应甚至优于Dex，呈一定剂量依赖性。上述结果提示解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位可干预淋巴细胞有丝分裂，抑制小鼠T淋巴细胞增殖，进而下调机体细胞免疫应答发挥免疫抑制作用。

B淋巴细胞受抗原——鸡红细胞刺激后，分化为浆细胞，浆细胞产生一种抗体——溶血素，当再次接受相同抗原刺激时，溶血素和抗原在补体的参与下发生免疫反应，产生溶血现象，而红细胞溶血与血清溶血素含量有关。因此，测定其上清液的吸光度，则可间接判断血清中溶血素水平，从而反映鸡红细胞免疫后小鼠的特异性体液免疫。本实验结果表明，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用，提示能够抑制小鼠的体液免疫应答。体外实验也证明不同剂量的解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位能够明显抑制B淋巴细胞增殖，且水溶性部位高剂量 （达到15μg/mL以上）的抑制效应优于Dex。这一结果与体内实验相一致，说明解毒活血滋阴方水溶性部位、乙酸乙酯部位具有抑制体液免疫的功能。

解毒活血滋阴方由白花蛇舌草、苏木、青蒿、山茱萸等药物组成，该复方所含成分包括：黄酮类、苯丙素类、萜类、挥发油、鞣质以及多种植物多糖、氨基酸等。现代药理研究表明，白花蛇舌草能够调节Th1/Th2细胞平衡，具有抑制免疫作用［11］；苏木乙酸乙酯提取物能够抑制淋巴细胞增殖，同时水提物能通过上调CD4+CD25+T细胞及Foxp3活性起到较强的免疫抑制作用［12-13］；青蒿素在体外明显抑制刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖，在体内能够减轻变应性接触性皮炎小鼠耳肿胀，降低小鼠的脾指数和胸腺指数，抑制NF-κB信号通路的活化，调节Th1/Th2免疫平衡，抑制炎症反应和免疫功能［9，14］；山茱萸总苷通过抑制大鼠细胞免疫功能，抑制弗氏完全佐剂所致免疫性炎症模型-大鼠佐剂性关节炎［15］。这些研究与本实验结果是相符的。

综上所述，解毒活血滋阴方水溶性部位和乙酸乙酯部位能明显抑制小鼠DTH反应；抑制对鸡红细胞诱导的小鼠血清溶血素生成；抑制T、B淋巴细胞增殖，具有较好的免疫抑制活性，是其治疗SLE的有效部位，但其调节免疫的作用机制还有待进一步研究。

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Screen of imMunosuppressive fractions froMJiedu Huoxue Ziyin Formula

BIAN Hua1， HAO Peng-fei1， LÜQin2， SHAN Shu-ling1， FUWei-yun1， ZHANG Li-fang1

（1.Medical School of Nanyang Instituteof Technology，Nanyang 473004，China；2.Nanyang Medical College，Nanyang 473061，China）

AIMTo separate and screen immunosuppressive active fractions froMJiedu Huoxue Ziyin Formula（JDHXZYF）for systemic lupus erythematosus.METHODSDifferent extracts of JDHXZYF were prepared with water-soluble，ether-soluble，ethyl acetate，n-butanol，and ethanolic fractions.The in vivo cell and humoral immunity responses of JDHXZYF componentswere observed by delayed-type hypersensitivity（DTH）in mice and the production of specific hemolysin antibody against fowl erythrocyte.The effects of different extract fractions on ConA-induced or LPS-induced T lymphocyte and B lymphocyte proliferation were determined in in vitro tests.RESULTSThe water-soluble and the ethyl acetate fraction could alleviate auricle swelling in DTH mice and decrease the thymus and spleen index，and the seruMhemolysin level induced by fowl erythrocyte.Meanwhile，the watersoluble and the ethyl acetate fractions of JDHXZYF had obvious effects on the proliferation of T lymphocyte and B lymphocyte in a concentration-dependentmanner in vivo.CONCLUSIONThe water-soluble fraction and the ethyl acetate fraction can be identified as immunosuppressive active fractions of JDHXZYF for systemic lupus erythematosus.

Jiedu Huoxue Ziyin Formula（JDHXZYF）；systemic lupus erythematosus；active fraction；immunosuppressive action

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0943-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.004

2014-09-01

河南省重点科技攻关计划项目 （102102310167）

卞 华 （1973—），男，副教授，博士，从事自身免疫性疾病的研究。Tel：（0377）62071311，E-mail：biancrown@163.com