连花清瘟胶囊对脂多糖致急性肺损伤小鼠IKK/IκB/NF-κB信号通路的影响

崔雯雯， 金 鑫， 张彦芬， 常丽萍， 王宏涛，3*

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.河北以岭医药研究院，河北 石家庄050035；3.河北省络病重点实验室，河北石家庄050035；4.国家中医药管理局心脑血管络病重点学科，河北石家庄050035）

连花清瘟胶囊对脂多糖致急性肺损伤小鼠IKK/IκB/NF-κB信号通路的影响

崔雯雯1， 金 鑫1， 张彦芬2，3， 常丽萍2，4， 王宏涛1，3*

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.河北以岭医药研究院，河北 石家庄050035；3.河北省络病重点实验室，河北石家庄050035；4.国家中医药管理局心脑血管络病重点学科，河北石家庄050035）

目的探讨连花清瘟胶囊对经气管内滴注脂多糖（LPS）致小鼠急性肺损伤引起的肺组织炎症因子和IKK/IκB/ NF-κB信号通路的蛋白表达的影响。方法将急性肺损伤的100只SPF级18～20 g雄性KM小鼠随机均分为5组，LPS组，地塞米松组，连花清瘟胶囊高、中、低剂量组，另设正常对照组 （n=20）。光镜下观察实验小鼠肺组织病理变化，流式细胞术检测外周血中白介素-6（IL-6）的阳性表达率，RT-PCR法检测肺组织中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA表达，Western blot检测肺组织中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表达。结果与正常对照组相比，LPS组小鼠肺组织中有大量炎性细胞渗出，外周血中IL-6，肺组织中MCP-1 mRNA，NE、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表达均明显升高；与脂多糖组相比，外周血中IL-6的阳性表达率用药组均有所下降，肺组织中MCP-1mRNA表达用药组均改善明显，肺组织中NE、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表达为地塞米松组与高剂量组改善较明显，连花清瘟中、低剂量组也有不同程度改善。结论连花清瘟胶囊能够通过降低IKK/IκB/NF-κB信号通路的表达来减轻肺内炎症反应程度。

连花清瘟胶囊；急性肺损伤；IKK/IκB/NF-κB信号通路

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由肺内外多种因素引起的多种炎症因子参与的过度的失控的炎症级联反应［1-2］。目前研究认为，NF-κB是调节急性肺损伤的多种炎症介质包括细胞因子、趋化因子的主要核转录因子［3-4］。NF-κB是一种具有多效性的核转录因子，参与多种细胞因子及炎性介质基因的转录调节，以三聚体形式存在于胞浆内的NF-κB激活主要依赖于NF-κB抑制剂（IκB）的磷酸化，IκB激酶（IKK）对NF-κB的降解也起到调控的作用，因此，IKK/IκB/NF-κB是一个有机联系的系统［5］。已有大量研究证明［6］， 脂多糖（LPS）经常被用于制备实验动物急性肺损伤模型，其成模性强且容易复制。连花清瘟胶囊 （连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草）具有广谱抗病毒、抑菌作用，对呼吸道、肺部感染均有一定的治疗作用［7］。因此，本研究采用LPS诱发小鼠急性肺损伤，探究IKK/IκB/NF-κB系统与急性肺损伤的联系及连花清瘟胶囊的干预作用。

1 仪器设备

3K15型低温高速离心机 （德国Sigma公司）；Leica RM2015切片机（德国Leica公司）；Olympus IX71荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；UVP凝胶扫描系统（美国UVP公司）；DYZ-22A型双恒定时电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYY-Ⅲ桥式电泳槽 （北京市六一仪器厂）。

2 药物与试剂

连花清瘟胶囊 （石家庄以岭药业股份有限公司）；地塞米松片 （批号130211，天津天药药业股份有限公司）；LPS（批号102M4017V，德国Sigma公司）；Western印迹检测抗体：NE兔抗小鼠多克隆抗体（英国Abcam公司）；NF-K B P65兔抗小鼠多克隆抗体（英国Abcam公司）；IκB alpha兔抗小鼠多克隆抗体（英国Abcam公司）；IKK beta兔抗小鼠单克隆抗体（英国Abcam公司）；RNA提取试剂Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（美国Promega公司）；琼脂糖（美国Promega公司）；荧光定量PCR试剂盒（加拿大BBI公司）。

3 动物饲养与分组实验

SPF级雄性KM小鼠120只，6周龄，体质量18～20 g，由中国食品药品检定研究院提供，合格证号：SCXK（京）2009-0017。实验前适应性喂养4 d后，随机分成6组，每组20只，分别为正常对照组，脂多糖组，地塞米松组，连花清瘟胶囊高、中、低剂量组。供试品采用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液，地塞米松组给予5 mg/kg的地塞米松，连花清瘟胶囊高、中、低剂量组分别给予8、4、2 g/kg的莲花清瘟胶囊，正常对照组和脂多糖组灌胃给予等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠，连续7 d，每天1次。

4 造模方法

末次给药24 h后，除正常对照组外其余5组，用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉后，将小鼠固定在手术板上，颈部消毒，纵向切开颈部皮肤，剥离皮下组织，暴露气管，用1 mL注射器注射脂多糖生理盐水溶液（5 mg/kg）2 ML，从气管两气管环间快速刺入注射，滴入后立即直立小鼠，轻度晃动数次以使液体能够均匀分布于肺内后缝合伤口，待小鼠自然清醒。

5 取材及指标检测

5.1 肺组织病理学检测 小鼠眼球取血后处死，开胸取肺。取左肺上叶组织块，放入10%甲醛溶液固定48 h，石蜡包埋，切片 （片厚5μm），于切片中任意抽取其中3张切片，HE染色。光镜下观察肺组织形态学改变。

5.2 流式细胞术法检测外周血中IL-6的阳性表达率 肝素抗凝，流式细胞仪检测IL-6。首先进行外周血单个核细胞的分离，然后采用佛波酯 （PMA）和离子霉素刺激淋巴细胞，应用流式细胞仪检测细胞，Exp32软件获取分析细胞，每个检测获取10 000个细胞，采用前向角 （FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，分析胞内抗原的表达。

5.3 实时定量PCR法检测MCP-1的mRNA表达水平 用Trizol试剂提取肺组织总RNA，进行cDNA的合成。实时荧光定量PCR检测肺组织中MCP-1的mRNA表达水平，引物序列如下：MCP-1，158 bp，正向5＇-ACTTCTATGCCTCCTGCTCAT-3＇，反向5＇-ACTGGCTGCTTGTGATTCTC-3＇；GAPDH，120 bp，正向5＇-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3＇，反向5-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3＇。以GAPDH为内参照基因，得到目的基因表达的相对定量值 （RQ值）。

5.4 Western blot法检测肺组织中NE、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表达 称取小鼠肺组织加入组织裂解液，匀浆后4℃离心分离上清，进行蛋白定量。取各组蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜后封闭，与一抗结合后洗膜，二抗结合，洗膜后采用增强型ECL化学发光法显色，扫描灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH比值表示。

6 统计方法

采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，实验数据为连续性变量用均数±标准差 （x±s）表示，用单因素方差分析进行检验，方差齐性，使用LSD法进行检验后多重比较，检验水准为0.05。

7 结果

7.1 光镜下观察肺组织病理形态学变化 正常对照组肺泡结构完整，未见明显充血、无炎细胞浸润、肺泡壁增厚等病理改变；脂多糖组可见肺泡腔内存在大量中性粒细胞为主、少量淋巴细胞和巨噬细胞的渗出物，有红细胞渗出，肺泡壁明显增厚，肺泡间质可见明显增生、水肿；地塞米松组较脂多糖组，炎细胞渗出明显减少，少量红细胞渗出，增生、水肿明显减轻；与脂多糖组比较，连花清瘟胶囊各剂量组小鼠肺部病理形态损伤均有不同程度改善，高剂量组可见少量中性粒细胞、红细胞等渗出物，水肿、增生等情况明显改善，中剂量组肺内可见炎症细胞浸润、红细胞渗出、增生等，但均有减轻；低剂量组仍可见大量中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞等渗出，肺泡壁薄厚不均，但较脂多糖组也有减轻。结果如图1。

7.2 外周血中IL-6的阳性表达率 脂多糖进入肺内后可致炎症细胞释放炎症因子IL-6。同正常对照组相比，脂多糖组小鼠外周血中IL-6的阳性表达率明显上升 （P＜0.01），提示小鼠体内炎症因子大量表达；同LPS组相比，连花清瘟胶囊各剂量组IL-6的阳性表达率均有所降低（P＜0.05）。结果见图2。

图1 小鼠肺组织病理形态学损伤Fig.1 Pathological in juries in lung tissues of theMice （HE staining，×400）

图2 外周血中IL-6的阳性表达率Fig.2 Expression rate of IL-6 in peripheral b lood

7.3 肺组织中MCP-1 mRNA的表达 脂多糖致肺损伤可致MCP-1大量表达，趋化炎症细胞聚集、浸润。同正常对照组相比，脂多糖组小鼠肺组织中MCP-1 mRNA的表达明显增多（P＜0.01）；同LPS组相比，连花清瘟胶囊各剂量组肺组织中MCP-1 mRNA的表达均有所降低（P＜0.01）。结果见表1。

7.4 肺组织中NE、NF-κB P65、IκBα、IKKβ的蛋白表达 脂多糖组小鼠肺组织中NE（中性粒细胞弹性蛋白酶）的蛋白表达均明显高于正常对照组 （P＜0.01），提示脂多糖进入肺内后引起中性粒细胞增多，大量释放NE；同脂多糖组相比，连花清瘟胶囊各剂量组表达量均有不同程度降低。IKK/IκB/NF-κB是一个有机的信号通路，与机体内炎症反应息息相关。脂多糖组小鼠肺组织中NF-κB P65、IκBα、IKKβ的蛋白表达均明显高于正常对照组 （P＜0.01）；连花清瘟胶囊各剂量组表达均较LPS组不同程度降低。结果见图3，表2。

图3 肺组织中NE、NF-κB P65、IKKβ、IκBα的蛋白表达Fig.3 Protein expression of NE、NF-κB P65、IKKβ and IκBαin lung tissues

表2 肺组织中NE、NF-κB P65、IKKβ、IκBα的蛋白表达Tab.2 Protein expression of NE、NF-κB P65、IKKβ、IκBαin lung tissues

8 讨论

急性肺损伤是由心源性以外的各种肺内外致病因素引起的以肺内大量炎细胞浸润和渗出、肺泡-毛细血管膜通透性增加为特征的肺部炎性综合反映，临床上常表现为顽固性低氧血症、进行性呼吸困难、非心源性肺水肿等，最终导致急性的进行性缺氧性呼吸衰竭，病死率高达30%～50%［8-9］。脂多糖 （LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，将LPS经由气管内滴入小鼠肺内后能够引起肺内炎症细胞增多、通透性改变等［10］。本研究中，脂多糖组小鼠肺内由病理染色可见大量炎细胞聚集，外周血中IL-6、肺组织中MCP-1、NE的表达明显升高，IL-6是肺内主要的炎症因子之一，参与肺损伤时肺内炎症的过度反应；MCP-1可以趋化和聚集中性粒细胞和巨噬细胞等炎细胞的聚集和浸润［11］；NE是中性粒细胞释放的一种参与肺损伤多环节的蛋白酶［12］。

NF-κB信号转导通路参与多种炎症反应中炎性介质基因的转录和调控，在急性肺损伤的病理机制中发挥重要作用。目前可知，NF-κB信号通路主要由p50（p105的处理产物）、p52（p100的处理产物）、p65（也称为Rel-A）、Rel-B、cRel等转录因子，7个NF-κB抑制蛋白如IκBα、IκBβ等和IκB激酶复合物IKKα、IKKβ、调节亚基NEMO组成，被分为经典途径和非经典途径两种信号转导通路。静止状态时，NF-κB以无活性的潜在状态存在于细胞浆中，它与抑制蛋白IκB结合组成一个三聚体p50-p65-IκB。在经典通路中，当细胞受到胞内外因素刺激传导至胞浆后，可激活NF-κB诱导性激酶（NIK），活化的NIK又激活IκB激酶IKK，作为促炎反应因子刺激诱导NF-κB激活的主要激酶的IKK复合体被活化，IKKα、IKKβ及NEMO组成的信号小体被激活后可磷酸化 p65蛋白，同时促使IκB磷酸化，使其因泛素化被蛋白酶体降解，胞浆内的p50和p65蛋白二聚体被解聚处于游离状态，活化的NF-κB一方面转位到胞核内快速诱导编码自身抑制剂IKBα的基因的转录，新合成的IκBα进入细胞核，使NF-κB与DNA解离并排出细胞核，等待重新激活。因此，IKK/IκB/NF-κB是一个有机的信号通路。另一方面，NF-κB游离后进入细胞核，与目的基因结合位点结合，启动下游炎症因子等基因的转录翻译，而这些炎症因子又成为了促进NF-κB重新激活的刺激因素，从而导致了级联性弥漫性炎症反应［13-16］。本研究中，脂多糖组肺组织中NF-κB、IκBα、IKKβ蛋白表达较正常对照组的增加，也说明了巨噬细胞、中性粒细胞等释放的炎症因子促使IKK复合物（IKKβ）激活了IκBα的磷酸化，使本与IκBα结合的NF-κB释放出来，游离进细胞核，从而启动了对下游炎症因子的转录翻译。这些炎症因子的产生能够促使炎症细胞大量产生、聚集，同时又重新启动IKK/IκB/NF-κB信号转导路径。

连花清瘟胶囊是广谱抑菌、抗炎的中药复方制剂，具有清瘟解毒、宣肺泄热的作用。既往研究显示［17-18］，它对急性呼吸道感染、急性炎症、慢性阻塞性肺部疾病均具有明显的治疗作用。本研究中，连花清瘟胶囊中、高剂量组能够降低NF-κB、IκBα、IKKβ的表达，同时降低外周血中IL-6、肺组织中MCP-1、NE的表达，说明在一定程度上能够抑制NF-κB转录因子的活化，减少炎症细胞浸润及释放炎症因子，降低免疫反应的放大程度，减轻了肺损伤。

综上所诉，NF-κB信号通路在内毒素致小鼠急性肺损伤的炎症反应过程中起到了重要的调控作用，在中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞释放的炎症因子刺激下可能参与并介导了整个炎症反应过程。连花清瘟胶囊通过抑制IKK/IκB/NF-κB信号转导系统、降低肺内炎细胞数量、减少炎症因子的表达，减轻了内毒素导致的肺损伤程度，但此过程具体与哪些炎症因子有关和整个反应中调控的具体机制，尚需进一步研究解释。

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Effects of Lianhua Qingwen Capsules on IKK/IκB/NF-κB signal pathway in the mouse w ith LPS-induced acute lung injury

CUIWen-wen1， JIN Xin1， ZHANG Yan-fen2，3， CHANG Li-ping2，4， WANG Hong-tao1，3*
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Yiling Medical Research Institute of Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China；3.Key Laboratory of Network Diseaseof Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China；4.Key Disciplinesof Cardio-Cerebral Vascular Network Disease，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050035，China）

AIMTo observe the effectsof Lianhua Qingwen Capsules on inflammatory factors and NF-kappa B signaling pathway in the acute lung injury induced by the intratracheal instillation of LPS in mice.METHODSOne hundred male SPF Kunmingmice weighing 18-20 g were randomly divided into five groups：LPSgroup，Lianhua Qingwen Capsules low，middle，and high dose groups，and Dexamethasone group.In addition，the pathological changes of the normal control groups in the lung tissues of the mice were observed by opticalmicroscopy. Flow cytometry detected expression rate of IL-6 in peripheral blood.The expression of MCP-1 mRNA was detected by RT-PCRmethod and the protein expression of NE，NF-κB，IKKβ，IκBαin the lung tissue was detected by Western blot.RESULTSCompared with the normal control group，the LPS group presented a large number of infiltrating inflammatory cells，markedly increased the expression rate of IL-6 in peripheral blood，MCP-1 mRNA and NE，NF-κB，IκBα，IKKβprotein expression in lung tissue ofmice.Compared with the LPS group，the expression rate of IL-6 in peripheral blood decreased and MCP-1 mRNA expression improved in three Lianhua Qingwen groups and Dexamethasone group.NE，NF-κB，IκBα，IKKβprotein expression improved in four treatment groups，especially in Lianhua Qingwen high dose group and Dexamethasone group while Lianhuaqingwen middle，low dose groups improved to some extent.CONCLUSIONLianhua Qingwen Capsules can reduce the inflammatory reaction through the reduction of the expression of IKK/IκB/NF-κB in the lungs.

Lianhua Qingwen Capsules；acute lung injury；IKK/IκB/NF-κB signaling pathway

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0953-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.006

2014-10-08

国家科技部 “十二五重大新药创制”（2011ZX09201-201-27）；河北省中医药管理局科研计划 （2014227）

崔雯雯（1991—），女，硕士生，从事中药药理学研究。E-mail：reaishenghuo0506@163.com

*通信作者：王宏涛（1972—），男，博士，高级工程师，从事糖尿病周围神经病变研究。E-mail：wanghongtao@yiling.cn