基于斑马鱼毒/效联合评价的强骨胶囊抗骨质疏松活性与安全性研究

王丹丹， 韦英杰*， 景莉君， 贾晓斌， 刘 超

（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.中国中医科学院江苏分院，江苏省中医药研究院，国家中医药管理局中药口服释药系统重点研究室，江苏南京210028；3.中国中医科学院江苏分院，江苏省中西医结合医院内分泌代谢病院区，江苏南京210028）

基于斑马鱼毒/效联合评价的强骨胶囊抗骨质疏松活性与安全性研究

王丹丹1，2， 韦英杰1，2*， 景莉君2， 贾晓斌2， 刘 超3

（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.中国中医科学院江苏分院，江苏省中医药研究院，国家中医药管理局中药口服释药系统重点研究室，江苏南京210028；3.中国中医科学院江苏分院，江苏省中西医结合医院内分泌代谢病院区，江苏南京210028）

目的用斑马鱼毒/效联合模型评价强骨胶囊 （骨碎补总黄酮）抗骨质疏松活性与初步安全性。方法将受精后3 d的斑马鱼幼鱼暴露在对照组 （0.4%DMSO胚胎培养用水），泼尼松龙组，依替膦酸二钠组和强骨胶囊组溶液中培养至9 d。采用茜素红对斑马鱼幼鱼头部骨骼染色，定量分析骨骼染色区域；将受精后24 h的健康斑马鱼胚胎置于不同浓度药物组中，观察记录给药后1至9 d的死亡数和3 d的斑马鱼幼鱼形态。结果25μmol/L泼尼松龙能够成功诱导斑马鱼骨量显著丢失。与模型组比较，25 mg/L的强骨胶囊及30 mg/L依替膦酸二钠阳性药均能显著抑制泼尼松龙诱导的斑马鱼头部骨骼染色面积和累计光密度值的下降；强骨胶囊对于9 d斑马鱼的半数致死质量浓度LC50为529.87 mg/L，400 mg/L强骨胶囊溶液处理48 h斑马鱼未见明显脏器中毒，当质量浓度大于500 mg/L强骨胶囊均导致斑马鱼心脏中毒，出现心膜出血、血细胞在心区堆积及囊肿等现象。其最低中毒浓度为有效剂量浓度的20倍。结论斑马鱼毒/效联合模型成功评价了强骨胶囊的抗骨质疏松活性及其初步安全性。

斑马鱼；强骨胶囊；毒性；骨质疏松

骨质疏松症（osteoporosis）是一种系统性骨病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏，表现为骨的脆性增加，从而增加了骨折的危险性，骨质疏松症是一种多因素所致的慢性疾病，尤其在老年人中发生率极高，已成为一个严重的社会问题。

将新鲜黄瓜每处理 20个果用清水洗净表面污染物，沥干后去除两端不可食用部分，切分为5~6 cm的节段，采用分瓣器六等分为黄瓜条。测定含水率、可溶性固形物含量（TSSC）、果肉厚度、种腔直径、果肉色差（L*、a*、b*值）、果皮硬度、果肉硬度、感官指标（口感、脆度）和出品率。

近年来，治疗骨质疏松症的药物越来越多，但西药的长期应用副作用较大使得中药的应用日益广泛，为了能够实现长期用药和减少不良反应，有必要在抗骨质疏松中药前期筛选中同时重视有效性和安全性。

骨碎补为水龙骨科多年生槲蕨类植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根茎，具有补肾、续伤、壮骨等功效，为历代常用药物。骨碎补根茎主要成分为骨碎补总黄酮，在升高骨密度，减轻骨质疏松症骨痛方面有显著的作用，越来越多的运用于防治骨质疏松症［1-2］。以骨碎补总黄酮为主要成分的中成药强骨胶囊是防治骨量减少 （肾阳虚证）、骨质疏松症的中药二类新药［3-4］，临床上常用于骨脆易折、关节疼痛及骨量减少等证候者。

模式生物斑马鱼在用于建立疾病模型，进行药物活性成分的高通量筛选及药物代谢的研究中应用越来越广泛［5-7］。本实验对强骨胶囊在斑马鱼胚胎中的安全性作了初步研究，并以斑马鱼骨质疏松模型评价强骨胶囊的抗骨质疏松活性，以进一步证实斑马鱼模型用于药物安全性和活性筛选的可行性和合理性，以期为中药抗骨质疏松的有效性与安全性的早期快速评价提供思路。

2.2 斑马鱼安全性的初步研究 将收集到的受精卵移入双纯水中，28.5℃培养箱中继续培养24 h待用。根据预实验，设定强骨胶囊 400、500、600、700、800、900 mg/L质量浓度组和对照组（含0.4%DMSO胚胎培养用水），将上面培养24 h的正常胚胎置于不同质量浓度的强骨胶囊溶液中，24孔板每孔6个胚胎，每个实验组18个胚胎。作用24 h更换1次强骨胶囊溶液，并于施药后48 h在显微镜下观察各实验组的主要脏器形态，观察并记录1～9 dpf斑马鱼的死亡数，将发育至3 dpf的斑马鱼置于载玻片上，使载玻片上留存少量溶液，待斑马鱼位置摆好后，在显微镜下进行观察和拍照［13］。为减少误差，以上实验重复3次。

1 材料与仪器

1.1 动物 斑马鱼成鱼由南京大学模式动物研究所提供，为德国Tubingen品系。

2.3 数据分析 用Excel软件对数据进行统计分析，计算各组所需数据的平均值、标准偏差及变异系数 （n=5～7），t-test比较各组差异［10-12］；利用数据统计软件SPSS 16.0计算强骨胶囊对9 dpf的斑马鱼半数死亡浓度。

2 方法

3.2 强骨胶囊对斑马鱼胚胎的安全性 各质量浓度组给药后2～9 dpf的斑马鱼死亡率结果如图4所示，强骨胶囊对斑马鱼 （9 dpf）的 LC50约为529.87 mg/L；资料表明在2～3 dpf斑马鱼胚胎的心血管能够发育完成［14］，显微镜下观察，受精后3 d的斑马鱼 （3 dpf）如图5所示，强骨胶囊400 mg/L质量浓度组幼鱼未出现异常症状，与对照组没有差异。强骨胶囊500、600、700 mg/L质量浓度组可以观察到幼鱼心脏区域心包囊肿大，心膜区有出血现象，血细胞在心脏区堆积，斑马鱼对刺激不敏感，静卧于孔板底部，随着质量浓度的增大，800、900 mg/L质量浓度组幼鱼心脏中毒症状更加明显，心跳微弱甚至停止，血液循环受阻甚至停止，幼鱼身体轮廓模糊，皮肤有溃烂迹象。

林雪川和黎永兰相遇于2012年。在他们共同的老师组织的一次饭局中，两人相识，闲聊中才发现两人都是观阁镇当地中学的校友。

1.2 仪器与试剂 Nikon Aphaphot-2 YS2显微镜（日本株式会社尼康公司）；Canon PowerShot ELPH 300HS（日本佳能株式会社）；XW-80A微型涡旋混合仪 （上海沪西分析仪器厂有限公司）；生化培养箱 SPX-80（宁波海曙赛福实验仪器厂）；KQ3200DE型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；Mettler ToledoAB135-分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Image pro plus 6.0专业图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）；强骨胶囊 （北京岐黄制药有限公司，批号121207025）；泼尼松龙 （苏州亚科化学试剂股份有限公司，批号YK2012020101）；二甲基亚砜 （国药集团化学试剂有限公司，批号20120331）；依替膦酸二钠（中国食品药品检定研究院，批号 101174-201001）；多聚甲醛 （成都市科龙化工试剂厂，批号20100504）；茜素红 S（郑州四季化工产品有限公司，批号Sj20110806）；MS-222（Acros Organics，批号A0288328）；水为Milli-Q system高纯水（美国Millipore公司）；其余试剂均为分析纯。

3 结果

3.1 强骨胶囊对抗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松的作用 受精后9 d的斑马鱼幼鱼的各浓度强骨胶囊组头骨染色的显微成像图如图1所示，与DMSO组相比，25μmol/L泼尼松龙（prednisolone）模型组的骨染色面积和累计光密度值 （IOD）明显降低，存在极显著性差异 （P＜0.01），表明泼尼松龙在此浓度能够成功诱导斑马鱼骨量减少。与泼尼松龙模型组比较，30 mg/L依替膦酸二钠（ED）溶液组中骨染色面积和累计光密度值 （IOD）显著升高；强骨胶囊组中，随着强骨胶囊质量浓度增加，斑马鱼头骨矿化面积和IOD值均随之增加，10 mg/L溶液中斑马鱼头骨矿化面积和IOD值与泼尼松龙组比较显著性增加 （P＜0.05），25 mg/L时，矿化面积和IOD值呈现极显著性增加 （P＜0.01）；但当质量浓度增加到50 mg/L时，矿化面积与模型组无明显差异，质量浓度增加至 100 mg/L时，矿化面积降低至模型组之下，实验结果见图2和图3。结果说明了10 mg/L和25 mg/L的强骨胶囊可对抗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松，而高质量浓度则无明显的壮骨活性。

图1 斑马鱼（9 dp f）幼鱼经各溶液处理后腹面头骨茜素红染色显微成像图Fig.1 Ventral view of zebrafish larvae（9 dp f）treated w ith 0.4%DMSO and Strong Bone Capsules groups

图2 强骨胶囊对斑马鱼头骨茜素红染色面积的影响（n=5～7，x±s）Fig.2 Effect of Strong Bone Capsules onMineralized area of mean pixel number of zebrafish larvae（n= 5～7，x±s）

2.1 给药及斑马鱼固定、骨骼染色 挑选健康的受精后3 d的斑马鱼幼鱼分成8组置24孔板，每组2孔，每孔8条幼鱼，以孵育的方式进行培养给药［8］，分为0.4%DMSO阴性对照组、25μmol/L泼尼松龙模型药物组、30 mg/L依替膦酸二钠溶液（含25μmol/L泼尼松龙）阳性药物组和1、10、25、50和 100 mg/L强骨胶囊溶液 （均含 25 μmol/L泼尼松龙）组，所有溶液均用培养基［9］进行稀释配制。每孔加入各溶液2 mL，放入28.5℃培养箱中培养。每天更换1 ML溶液，培养至受精后9 d。由于斑马鱼体内卵黄囊含有丰富的营养可支持其存活9～10 dpf（days post fertilization）。用MS-222麻醉处死，每孔用4%多聚甲醛溶液固定过夜，依次按照本课题组前期处理方法进行3% H2O2漂白、1%KOH配制的茜素红溶液染色、不同比例1%KOH和甘油的混合溶液透化等步骤，最后将幼鱼保存于纯甘油中。将幼鱼置于载玻片上摆好位置，使背面向上，用显微镜和相机采集图像，图像放大倍数为10×10。对拍摄的染色图片做好标记采用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0计算头部骨骼染色面积和累积光密度［10-12］。

综上所述，在白内障小切口手法超乳术中予以患者优质护理，可缩短手术时间，优化视力恢复程度，降低并发症发生率，提升护理满意度，效果可观。

图3 强骨胶囊对斑马鱼头骨茜素红染色累计光密度的影响（n=5～7，x±s）Fig.3 Effect of Strong Bone Capsules on integrated optical density（IOD）of mean pixel number of zebrafish larvae（n=5～7，x±s）

图4 强骨胶囊各质量浓度组溶液处理后斑马鱼（2～9 dpf）死亡率Fig.4 Mortality of zebrafish（2-9 dpf）treated w ith 0.4%DMSO and Strong Bone Capsules groups

图5 强骨胶囊对受精后3 d的斑马鱼幼鱼 （3 dpf）的心血管形态的影响。Fig.5 Effects on morphology of zebrafish（3 dp f）treated w ith 0.4%DMSO and Srong Bone Capsu les groups

4 讨论

作为一种新型的脊椎模式动物，斑马鱼最初主要用于发育和遗传学研究中。由于斑马鱼胚胎透明，药物对其体内器官的毒性作用可以直接被观察到，比如血液循环以及心脏结构和功能的改变［13］。此外，斑马鱼胚胎期的发育特点也特别适合药物的心血管安全性研究［15-16］。本实验用这一模型进行了市售药物强骨胶囊的初期心血管短期内安全性的研究，关于长期和慢性方面的安全性有待进一步研究。文献表明斑马鱼幼鱼头骨发育包含骨形成和骨吸收的较完整体系［17］，由于体外细胞和整体哺乳动物实验存在有诸多限制，在国外，斑马鱼骨质疏松模型已渐被作为较为成熟的一种介于单二者之间的在体模式动物模型用于药物（如licochalcone A）抗骨质疏松作用评价［18］，本实验室课题组近些年也做了大量的斑马鱼骨质疏松模型筛选壮骨药物的研究，均取得了良好的预期效果［10-12］。

这样学生可以将之前所学的内容融合到本课的写作之中，学生既复习了之前的知识，又有了写作的方向，写作的难度就得到了分解，有利于学生写作能力的提高。

相关大鼠骨质疏松实验模型研究和临床数据表明强骨胶囊具有抗骨质疏松的药理作用［19-20］，本实验研究结果表明，斑马鱼模型成功评价了强骨胶囊的抗骨质疏松活性，数据显示强骨胶囊在25 mg/L具有最为显著的抗骨质疏松活性，在质量浓度增加至50 mg/L和100 mg/L时，头骨染色面积和累计光密度值有所降低，表明药物的壮骨活性不是随着质量浓度增大而效应增强的，这可能与药物在斑马鱼体内的吸收和代谢有关，具体原因有待进一步研究。质量浓度在500 mg/L及以上对斑马鱼幼鱼的心血管发育有影响，且随着质量浓度增加，症状加重，显示出抗骨质疏松有效剂量浓度与出现中毒症状浓度相差近20倍，提示强骨胶囊治疗骨质疏松的临床剂量范围内是安全的，与现有动物模型报道的结论具有一致性［20-21］。这一模型用于考察药物毒/效关系的应用值得进一步研究和推广。

［1］盛 彤，田金洲，胡玉宁，等.强骨胶囊治疗原发性骨量减少 （肾阳虚证）的Ⅰ临床研究［J］.中国医药学报，2002，17（7）：413-415.

［2］王和鸣，田金洲，彭淑莲，等.强骨胶囊治疗骨质疏松早期骨量减少的临床观察［J］.中国骨伤，2003，16（11）：692-694.

［3］王 林，汪建平.骨质疏松症的预防和治疗进展［J］.西北药学杂志，2003，18（5）：234-236.

［4］眭承志，樊孝俊，林景雄，等.骨碎补总黄酮治疗老年性骨质疏松症 （低转换型）生命质量的评价［J］.光明中医，2012，27（1）：15-20.

［5］舒 斌，韦英杰，张陆勇，等.采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性［J］.云南中医学院学报，2010，33（1）：35-37.

［6］韦英杰，贾晓斌，詹 扬，等.白杨素在模式生物斑马鱼中的代谢研究［J］.中国药学杂志，2013，48（7）：565-568.

［7］韦英杰，王长梅，蔡雪婷，等.地塞米松影响骨骼发育的斑马鱼模型的建立［J］.药学学报，2013，48（2）：255-260.

［8］王长梅，韦英杰，贾晓斌，等.泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型的建立［J］.世界科学技术-中医药现代化，2013，15（3）：509-514.

［9］Brand MG，Granato M，Nusslein-Volhard C.Keeping and raising zebrafish［M］.Oxford：Oxford University Press，2002：7-38.

［10］王长梅，景莉君，韦英杰，等.利用斑马鱼模型评价川续断皂苷Ⅴ和Ⅵ的抗骨质疏松活性［J］.中国药科大学学报，2014，45（1）：88-91.

［11］詹 扬，韦英杰，王长梅，等.淫羊藿总黄酮对泼尼松龙诱导斑马鱼致骨质疏松的防治作用［J］.中国医院药学杂志，2014，34（4）：251-255.

［12］詹 扬，韦英杰，王长梅，等.基于斑马鱼模型评价微量淫羊藿苷和朝藿定B的抗骨质疏松活性［J］.中国药学杂志，2014，49（1）：30-35.

［13］张利军，史慧勤，苑晓燕，等.多柔比星斑马鱼胚胎心脏发育毒性表现［J］.中国药理学与毒理学杂志，2013，27（2）：429-432.

［14］Stainier D Y.Zebrafish genetics and vertebrate heart formation［J］.Nat Rev Genet，2001，2（1）：39-48.

［15］Sehnert A J，Huq A，Weinstein BM，etal.Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility［J］.Nat Genet，2002，31（1）：106-110.

［16］张利军.斑马鱼心脏毒性评价模型的建立及美托洛尔心脏毒性作用机制研究 ［D］.北京：中国人民解放军军事医学科学院，2012.

［17］Fleming A，Sato M，Goldsmith P.High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish［J］.J Biomol Screen，2005，10（8）：823-831.

［18］KiMSN，Bae S J，Kwak H B，et al.In vitro and in vivo osteogenic activity of licochalcone A［J］.Amino Acids，2012，42（4）：1455-1465.

［19］谢雁鸣，许勇钢，赵晋宁，等.骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨密度和细胞因子IL-6、IL-4、TNFα水平的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2004，10（1）：34-37.

［20］谢雁鸣，赵普宁，张文军，等.强骨胶囊抗维甲酸所致大鼠骨质疏松症的实验研究［J］.中药新药与临床药理，1998，9（4）：217-220.

［21］谢雁鸣，赵晋宁，李映欧，等.强骨胶囊对Beagle犬的长期毒性试验［J］.中药药理与临床，1999，15（5）：29-31.

Anti-osteoporotic activity and safety of Strong Bone Capsules based on joint evaluation of toxicity and effect on zebrafish

WANG Dan-dan1，2， WEIYing-jie1，2*， JING Li-jun2， JIA Xiao-bin2， LIU Chao3
（1.Department of Pharmaceutics，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Key Laboratory of Oral Drug Delivery SysteMof Chinese Meteria-Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Branch of China Academy of ChineseMedical Science，Nanjing 210028，China；3.Endocrine and DiabetesCenter，Jiangsu Province Hospital on Integration of Chineseand Western Medicine，Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Science，Nanjing 210028，China）

AIMTo use zebrafish to evaluate the preliminary safety and anti-osteoporosis activity of Strong Bone Capsules（total flavones froMDrynaria fortunei（Kunze）J.Sm）.METHODSZebrafish larvae were coexposed with the vehicle control group（0.4%DMSO），prednisolone group，etidronate disodiuMgroup，and different concentrations of Strong Bone Capsules with 25μmol/L prednisolone froM3 to 9 days post fertilization（dpf）.Zebrafish skeletons at9 dpfwere fixed for stainingwith alizarin red.Quantitative analysis of the stained area was performed.Zebrafish embryos 24 hours post fertilization（hpf）were exposed with various concentrations of Strong Bone Capsules；embryonic morphology of zebrafish（3 dpf）was examined and the death number of the embryos was counted froM2 to 9 dpf.RESULTSThe results indicated that25μmol/L prednisolone could make zebrafish bone loose significantly，and when compared with the model group，25 mg/L Strong Bone Capsules and etidronate disodiuMcould restrain the decline of themineralized area and integrated optical density（IOD）in the head bone.The lethal concentration of 50%（LC50）of Strong Bone Capusles to zebrafish（9 dpf）was 529.87 mg/L；embryos（48 hpf）exposure to 400 mg/L Strong Bone Capsules did not show obvious organ toxicity，while cardiac toxicity of the zebrafish embryo appeared when the concentration was higher than 500 mg/L，such as endocardiuMbleeding，aggregation of blood cells in the chambers aswell as swelling of the heart.TheminimuMtoxic concentration was 20 times of the effective dose.CONCLUSIONThe zebrafish model is successfully used in evaluating anti-osteoporosis activity and preliminary safety of Strong Bone Capsules.

zebrafish；Strong Bone Capsules；toxicity；osteoporosis

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0938-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.003

2014-07-18

江苏省自然科学基金资助项目 （BK20141507；BK2011866），江苏省六大人才高峰（2013-YY006），2014年度江苏省第四期“333工程”科研资助项目 （BRA2014348）

王丹丹 （1986—），女，硕士生，研究方向为中药药效物质基础。

*通信作者：韦英杰 （1970—），女，博士，研究员，研究方向为中药药效物质基础与质量控制。Tel：（025）85637809，E-mail：wyj970@163.com