高良姜素对H2O2诱导A375细胞氧化损伤的保护作用

彭晓明，霍仕霞，高 莉，甘 萍，何 燕，闫 明＊（.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049；.石河子大学药学院，石河子 83003）

高良姜素对H2O2诱导A375细胞氧化损伤的保护作用

彭晓明1，霍仕霞1，高 莉1，甘 萍2，何 燕2，闫 明1＊（1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049；2.石河子大学药学院，石河子 832003）

目的 探讨高良姜素对人A375黑素瘤细胞氧化损伤的保护作用。方法 以700μmol·L－1的H2O2处理人A375黑素瘤细胞，建立氧化损伤模型，并以1，5和10μg·mL－1的高良姜素拮抗其作用。用倒置显微镜观察细胞形态；采用MTT比色法检测细胞存活率；并检测各组细胞上清液中丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T－AOC）、过氧化氢酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）。结果 高良姜素能明显改善H2O2损伤后的A375细胞形态，显著提高人A375黑素瘤细胞的存活率。与模型组相比，高良姜素给药后均能提高A375细胞T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px活力（P＜0.05），而MDA和NOS明显降低（P＜0.05）。结论 高良姜素对H2O2诱导的A375细胞氧化损伤具有保护作用。

高良姜素；H2O2；人A375黑素瘤细胞；氧化损伤

白癜风是临床常见的色素脱失性疾病，其发病机制尚无定论，主要包括自体细胞毒素学说、免疫学说、神经学说与遗传学说。近年来，白癜风的氧化应激学说越来越受到关注［1－3］。氧化应激是由于白癜风患者的氧化与抗氧化机制失衡，导致局部微环境中聚集大量活性自由基，可直接或间接地催化产生一系列的活性氧化产物（包括超氧阴离子、H2O2、羟自由基），在局部蓄积使黑素细胞破坏或导致黑素生成障碍。

高良姜素（galangin）是一种天然的黄酮类化合物，主要提取自中药材高良姜的根茎［4］。已有文献报道［5－6］，高良姜素具有抗氧化能力，本研究以H2O2诱导的体外培养人黑素瘤细胞A375为研究对象，观察不同质量浓度的高良姜素对A375细胞的氧化损伤保护作用，为高良姜素在制备通过氧化应激治疗白癜风药物中的应用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 超净工作台（SW－CJ－1F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；倒置显微镜（37XB，上海光学仪器六厂）；CO2培养箱（MCO－18AIC，日本三洋公司）；全波长酶标仪（Multiskan Go 1510，美国Thermo Fisher公司）。

1.2 试药 高良姜素（批号20110921，质量分数≥99.9%）购自上海永恒生物有限公司。双氧水（质量分数为30%的H2O2），分析纯，购于天津市福晨化学试剂厂；达尔伯克必需基本培养基（DMEM）购自Gibco公司；胎牛血清为Hyclone产品；氨苄青霉素钠和硫酸链霉素购自Amersco公司；维生素E（VE）和HEPES购自上海源叶生物科技有限公司；碳酸氢钠（NaHCO3）购自于天津市福晨化学试剂厂。超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（批号20130717）、微量丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号20130711）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（批号20130628）、总抗氧化能力（T－AOC）测定试剂盒（批号20130628）、一氧化氮合酶（NOS）测定试剂盒（批号20130717）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）测定试剂盒（批号20130723），均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 细胞株 人A375黑素瘤细胞系购自于中国科学院细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养 将人A375黑素瘤细胞以1×106个·mL－1接种于含体积分数为10%的胎牛血清、3.7g·L－1NaHCO3、2.5g·L－1HEPES、100u·mL－1青霉素和100u·mL－1链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每隔2d换1次液。

2.2 细胞损伤模型的建立 当培养瓶中A375细胞融合率达到80%左右时，以质量分数为0.25%胰酶消化细胞，DMEM培养基调节细胞密度至3×105个·mL－1，200μL／孔铺至96孔培养板。培养24h后吸弃培养基，分别加入400，500，600，700和800μmol·L－1的H2O2作用24h。然后于每孔加入5mg·mL－1的MTT 20μL，继续培养4h，吸弃培养液，加入DMSO 200μL充分震荡溶解后，于全波长Multiskan Go 1510酶标仪测定490nm处吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率＝A给药／A正常×100%，正常组细胞存活率记作100%。筛选细胞存活率在50%～80%之间的H2O2浓度作为最佳诱导浓度。

2.3 细胞给药及细胞存活率测定 A375细胞培养48h后分组给药，将细胞分为6组：正常对照；H2O2模型组；维生素E（20μg·mL－1）阳性药组、高良姜素低（1μg·mL－1）、中（5μg·mL－1）、高（10μg·mL－1）剂量组；模型组和给药组先用700μmol·L－1H2O2作用24h，弃去原培养液，正常组与模型组加入不含胎牛血清的DMEM培养基，阳性药组加入含20μg·mL－1维生素E，高良姜素低、中、高剂量分别加入含1，5和10μg·mL－1的新鲜培养基，孵育24h，于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。按照2.2项下方法测定490nm处吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率＝A给药／A正常×100%，正常组细胞存活率记作100%。

2.4 细胞培养液中生化指标测定 细胞分组及给药方法同上，收集细胞培养上清液，按照购买试剂盒说明书描述的方法，测定各组细胞上清中MDA含量、T－AOC抗氧化能力及CAT、NOS、SOD和GSH－Px活性。

2.5 统计学处理 采用统计学分析软件SPSS17.0处理，所有数据均采用x±s表示，应用t检验进行显著性分析，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示差异极显著。

3 结果

3.1 H2O2诱导A375氧化损伤的浓度筛选 如表1所示，采用700μmol·L－1的H2O2孵育24h可使人A375黑素瘤细胞的存活率降至58.43%，故确定该浓度为氧化损伤最佳诱导浓度。

表1 不同浓度H2O2损伤人A375黑素瘤细胞存活率的影响Tab.1 The effect of H2O2on A375cell survival rate

3.2 高良姜素对H2O2诱导的A375细胞形态的影响 见图1。由图1可知，正常A375细胞轮廓层次较分明，细胞膜光滑完整，有光泽，细胞胞体较大，细胞数量也较多，细胞形态主要以梭形为主、双极或三级贴壁生长，可与周围细胞融合，呈片状，形成单细胞层；H2O2模型组的细胞轮廓层次较差，树突缩短或消失，贴壁细胞数量减少，胞体皱缩，且部分细胞呈圆形，悬浮于培养液中。给予阳性药VE及高良姜素低、中、高各剂量组，其相对于模型组而言，A375细胞数量增多，细胞突起增多并交织呈网状，胞体皱缩现象明显改善。提示高良姜素对H2O2损伤人A375黑素瘤细胞具有保护作用。

图1 高良姜素对H2O2诱导人A375黑素瘤细胞损伤保护的细胞形态局部图（×200）1.正常组；2.模型组；3.VE（20μg·mL－1）；4.高良姜素（1μg·mL－1）；5.高良姜素（5μg·mL－1）；6.高良姜素（10μg·mL－1）Fig.1 The effect of galangin on A375morphology induced by H2O2（×200）1.normal group；2.model group；3.VE（20μg·mL－1）；4.galangin（1μg·mL－1）；5.galangin（5μg·mL－1）；6.galangin（10μg·mL－1）

3.3 高良姜素对H2O2诱导的A375细胞存活率的影响 如表2所示，MTT检测发现氧化损伤后的A375细胞经高良姜素（1，5和10μg·mL－1）作用24h后，其细胞存活率由66.67%提高至91.43%，105.24%和114.66%。

表2 不同浓度高良姜素对H2O2损伤人A375黑素瘤细胞存活率的影响Tab.2 The effect of galangin on cell survival rate of A375induced by H2O2 ±s，n＝8）

表2 不同浓度高良姜素对H2O2损伤人A375黑素瘤细胞存活率的影响Tab.2 The effect of galangin on cell survival rate of A375induced by H2O2 ±s，n＝8）

注：与正常组比较＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 浓度／μmol·L－1 A490 存活率／% 114.66 0.39±0.08 100模型组 0.26±0.02＃＃ 66.67 VE 20 0.35±0.01＊ 88.38高良姜素 1 0.36±0.03＊＊ 91.43高良姜素 5 0.41±0.03＊＊ 105.24高良姜素 10 0.45±0.04＊＊正常组

3.4 高良姜素对H2O2损伤人A375黑素瘤细胞氧化指标的影响 见表3。由表3可知，A375细胞经H2O2诱导24h后，与正常组比较，其细胞上清液中MDA含量、NOS活性升高，T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性则出现不同程度的降低。而经高良姜素（1，5和10μg·mL－1）处理24h后，与模型组比较，除低剂量组（1μg·mL－1）外，细胞MDA和NOS均显著降低（P＜0.05），而T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性则明显升高（P＜0.05）。

表3 高良姜素对H2O2诱导的A375细胞培养液中MDA、T－AOC、CAT、NOS、SOD和GSH－Px的影响Tab.3 The effect of galangin on MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxin A375induced by H2O2 （±s，n＝8）

表3 高良姜素对H2O2诱导的A375细胞培养液中MDA、T－AOC、CAT、NOS、SOD和GSH－Px的影响Tab.3 The effect of galangin on MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxin A375induced by H2O2 （±s，n＝8）

注：与正常组比较＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 剂量／μg·mL－1MDA／nmol·mL－1T－AOC／mmol·mL－1CAT／U·mL－1NOS／U·mL－1SOD／U·mL－1GSH－Px／U·mL－198±0.69 53.77±4.01模型组 0.61±0.02＃＃ 1.21±0.03＃＃ 0.23±0.01＃＃ 2.24±0.08＃ 10.04±0.02＃＃ 28.81±8.96＃VE 20 0.49±0.01＊ 1.60±0.01＊ 0.58±0.01＊＊ 1.21±0.02＊ 17.79±0.54＊＊ 44.62±6.32＊高良姜素 1 0.57±0.04 1.23±0.01 0.23±0.02 1.98±0.04 10.45±0.09 30.61±9.11高良姜素 5 0.47±0.01＊＊ 1.49±0.02＊＊ 0.25±0.02＊ 0.88±0.04＊＊ 12.36±0.74＊＊ 35.49±4.17＊高良姜素 10 0.41±0.02＊＊ 1.62±0.03＊＊ 0.73±0.01＊＊ 0.90±0.02＊＊ 19.42±0.51＊＊ 50.77±3.22正常组 0.33±0.01 2.15±0.01 3.21±0.04 1.05±0.01 13.＊＊

4 讨论

白癜风的发病机制至今仍未明确，但越来越多的证据表明［7－9］，白癜风患者体内存在氧化应激现象。正常生理状态下，表皮氧化与抗氧化系统处于动态平衡状态。人体在代谢过程中会不断产生活性氧簇ROS（O2－、H2O2、OH－等）与机体内的抗氧化防御系统（SOD、GSH－Px、CAT等）处于平衡状态。但当机体受到外来药物或刺激时所产生的ROS量超出机体自身清除量时，这种平衡即被打破，进而发生氧化应激状态，导致相关疾病的发生发展。Schallreuter等［9］在进展期白癜风患者表皮检测到高浓度H2O2聚集。谷梅等［10］研究发现，正常人表皮黑素细胞经一定浓度H2O2处理后，使得酪氨酸酶活性降低，黑素合成减少，丙二醛含量增多，提示H2O2在白癜风发病中可能起到一定的作用。

白癜风的基本病理改变是表皮黑素细胞部分或完全缺失，同时伴有外周血及皮损区的生化指标改变。Jalel等［11］研究表明，白癜风小鼠外周血中MDA水平显著高于对照组，而CAT、SOD、GSH－Px活性低于对照组，进一步从动物实验水平揭示了白癜风与氧化应激密切相关。此外，白癜风患者表皮中诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性增加［1］，进而引起NO含量增加。NO可影响黑素细胞与细胞外机制的粘附，抑制黑素细胞增殖，高浓度的NO能导致黑素细胞死亡。H2O2是一种重要的活性氧，极易通过细胞膜进入胞内，在细胞内通过Fenton反应形成高活性的自由基，进一步造成细胞损伤［12］。本研究利用700μmol·L－1的H2O2诱导A375细胞24h，与正常组细胞相比，其细胞存活率降至66.67%，表明氧化损伤模型成功建立。经不同质量浓度高良姜素（1，5和10μg·mL－1）作用后，A375细胞形态及细胞存活率明显改善。与模型组比较，除低剂量组（1μg·mL－1）外，其余各给药组细胞MDA和NOS均显著降低（P＜0.05），而T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性则明显升高（P＜0.05）。研究结果表明，高良姜素在5～10μg·mL－1范围内，对H2O2诱导A375细胞具有显著保护作用，其作用机制可能与其激活抗氧化防御系统、抑制细胞内活性氧簇的生成有关。

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Protective effects of galangin on oxidative damage of A375induced by H2O2

PENG Xiaoming1，HUO Shixia1，GAO Li1，GAN Ping2，HE Yan2，YAN Ming1＊（1.Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Prescription Laboratory of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China；2.Pharmaceutical College of Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Objective To investigate the protective effect of galangin on oxidative damage of A375induced by H2O2.Methods A375 oxidative damage cellular model was established by 700μmol·L－1H2O2treatment.And the damage effect was antagonized by different concentration（1，5and 10μg·mL－1）galangin.The cell morphology was observed by inverted microscope，the cell survival was determinated by MTT，and the changes of MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxwere measured.Results The galangin could significantly improve the cell morphology and the cell survival.Compared with the model group，galangin could significantly increase the activity of T－AOC，CAT，SOD and GSH－Px（P＜0.05），and the production of MDA and NOS was inhibited obviously（P＜0.05）.Conclusion The galangin has significant protective effect on the A375oxidative damage cellular model induced by H2O2.

galangin；H2O2；A375；oxidative damage

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.014

R965

A

1004－2407（2015）01－0051－04

2014－06－20）

新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2013211B65）

彭晓明，男，硕士

＊通信作者：闫明，男，研究员