RP－HPLC法测定开西尼孜散剂中没食子酸和鞣花酸的含量

李建梅，祖里皮亚·塔来提，库尔班尼沙·买买提，希尔艾力·吐尔逊（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所维吾尔医方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830049）

·药物分析·

RP－HPLC法测定开西尼孜散剂中没食子酸和鞣花酸的含量

李建梅，祖里皮亚·塔来提，库尔班尼沙·买买提，希尔艾力·吐尔逊＊（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所维吾尔医方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830049）

目的 建立同时测定开西尼孜散剂中没食子酸和鞣花酸含量的RP－HPLC方法。方法 色谱柱为Waters X－Bridge C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－乙腈－2mL·L－1磷酸水溶液，梯度洗脱；流速为1.0mL·min－1；检测波长为254nm。结果 没食子酸和鞣花酸的线性范围分别为0.132～0.792μg（r＝0.999 9）和0.108～0.648 2μg（r＝0.999 9），平均加样回收率分别为99.3%和98.8%，方法精密度RSD分别为1.4%和1.7%（n＝6）。结论 该方法操作简便、快速、准确、灵敏度高、重复性好，可为开西尼孜散剂质量评价提供实验依据。

没食子酸；鞣花酸；反相高效液相色谱法；开西尼孜散剂

开西尼孜散剂是由芫荽籽、毛诃子、诃子肉、余甘子等5味药材组成的复方制剂，具有清理血热、止痛安神功效，用于各种异常胆液质性头痛、热性心悸、恶心、目花、耳鸣等［1］。由于原剂型为颗粒剂，鉴于维药传统剂型的优化工艺及应用研究，对该颗粒剂进行改剂型研究，为后期的剂型对比研究奠定基础。本文就开西尼孜散剂进行定量研究，处方中的多味药材均含有没食子酸和鞣花酸，本文采用HPLC法对该散剂中的没食子酸和鞣花酸进行含量测定，为开西尼孜散剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪及化学工作站（美国沃特斯公司）；Waters 2996二极管阵列检测器，Empower数据采集系统；Milli－Q超纯水纯化系统（18MΩ，Millipore公司）；SGT7200HBT型超声清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）。

1.2 试药 没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：110831－200302）；鞣花酸对照品（北京世纪奥科生物技术有限公司提供，供含量测定用，批号476－66－4）；开西尼孜散剂（由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药剂研究室提供，批号20100210）；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水；磷酸、乙酸（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥过夜的没食子酸与鞣花酸对照品适量，置于25mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为0.132和0.108mg·mL－1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取开西尼孜散剂成品约3.0g，置于50mL的棕色量瓶中，加体积分数50%甲醇溶液20mL，超声处理（59kHz）30min，加体积分数50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤；精密吸取2mL，置于10mL棕色量瓶中，以体积分数50%甲醇溶液稀释并定容，过滤，即得［2］。

2.2 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱：Waters X－Bridge C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（A）－乙腈（B）－2mL·L－1磷酸水溶液（C）梯度洗脱：0～14min（4%～4%A，0%～0%B），14～15min（4%～30%A，0%～8%B），15～35min（30%～32% A，8%～10%B）；流速：1.0mL·min－1；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL［3－5］。理论板数按没食子酸峰计算不低于3 000，分离度不低于1.5。色谱图见图1。

图1 HPLC图A.混合对照品；B.开西尼孜散剂样品；1.没食子酸；2.鞣花酸Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances；B.Kaixinizi Pulvis samples；1.gallic acid；2.ellagic acid

2.3 线性关系考察 精密吸取上述没食子酸对照品储备溶液（0.132mg·mL－1）、鞣花酸对照品储备溶液（0.108mg·mL－1）2.5mL，分别置于10mL棕色量瓶中，加甲醇稀释并定容得33μg·mL－1没食子酸对照品溶液、27μg·mL－1鞣花酸对照品溶液，从中分别精密吸取4.0，8.0，12.0，16.0，20.0和24.0μL，分别注入液相色谱仪，以进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线［6］。没食子酸的线性回归方程：Y＝2 782 286.36 X－5 660.5，r＝0.999 9（n＝6）；鞣花酸的线性回归方程：Y＝3 226 341.27 X－41 188.0，r＝0.999 9（n＝6）。结果表明，没食子酸进样量在0.132～0.792μg范围内线性关系良好；鞣花酸进样量在0.108～0.648 2μg范围内线性关系良好。

2.4 精密度实验 精密吸取质量浓度为13.20 μg·mL－1的没食子酸和10.80μg·mL－1的鞣花酸混合对照品溶液15μL，重复进样6次，分别测定峰面积，结果没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为1.40%和1.71%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验 精密称取同一批开西尼孜散剂6份，按上述2.2.2项下方法操作，制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定。结果没食子酸和鞣花酸含量的RSD（n＝6）分别为1.30%和2.17%，说明该方法的重复性良好。

2.6 稳定性实验 取同一供试品试液，室温放置，分别于0，2，4，6，8和12h按上述色谱条件测定。结果没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为0.87%和2.51%。结果表明，供试品溶液室温放置12h内稳定。

2.7 加样回收率实验 采用标准添加法测定回收率。精密称取同一批号的供试品9份，每份约0.05g，置于10mL量瓶中，分成3组，每组分别加入质量浓度为0.132mg·mL－1的没食子酸对照品溶液0.5，1.0和1.5mL，加入体积分数50%甲醇溶液适量超声提取30min，定容，制备低、中、高3个不同质量浓度的供试品溶液，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，测定，平均回收率为99.3%，RSD为1.4%。结果见表1。

表1 没食子酸加样回收率结果Tab.1 Results of gallic acid sample recovery experiments

精密称取同一批号的供试品9份，每份约0.07g，放10mL量瓶中，分成3组，每组分别加入质量浓度为0.108mg·mL－1的鞣花酸对照品溶液0.5，1.0和1.5mL，加入体积分数50%甲醇适量，超声10min，定容，制备低、中、高3个不同质量浓度的供试品溶液，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，测定，平均回收率为98.8%，RSD＝1.7%。结果见表2。

表2 鞣花酸加样回收率结果Tab.2 Results of ellagic acid sample recovery experiments

2.8 样品测定 准确称取开西尼孜散剂样品约3.0g，按2.2.2项下方法制成供试品溶液，于样品放置不同时间测定没食子酸和鞣花酸峰面积并计算含量，结果见表3。实验结果表明，开西尼孜散剂样品室温放置时1g平均含没食子酸2.01mg、含鞣花酸2.80mg。

表3 样品测定结果Tab.3 Results of sample content determination

3 小结与讨论

3.1 检测波长的选择 经过全波长扫描结果，没食子酸和鞣花酸分别在254和270nm波长处有最大吸收，为了在相同条件下同时检测2种成分，缩小样品中2种成分峰面积差别，最终选择254nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择 对甲醇－2mL·L－1磷酸溶液、甲醇－2mL·L－1乙酸溶液、甲醇－乙腈－2mL·L－1磷酸溶液、乙腈－2mL·L－1磷酸溶液等多种不同比例的流动相进行比较，发现甲醇－乙腈－2mL·L－1磷酸溶液梯度洗脱时分离效果最好，且出峰时间快，故选择本系统为流动相［5］。

3.3 提取方法的选择 根据文献结果选择甲醇作为提取溶剂，分别考察了体积分数20%甲醇、50%甲醇和甲醇的超声和回流的不同提取方式，并对提取时间进行了考察。结果表明，以体积分数50%甲醇超声提取30min即可提取完全，供试品中2个主要成分可以达到较好的分离效果和提取率，因此，确定用该提取方法。在实验过程中发现，样品含量不宜过高，否则峰形易拖尾变形。

3.4 样品放置时间考察 根据本课题研究需要，对样品放置时间需进行考察，发现开西尼孜散剂样品放置60d内没食子酸和鞣花酸含量均未见显著性变化，认为该散剂处方中2种成分的含量均较稳定，质量可控。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：190.

［2］王勤，孙芸.HPLC法测定锁阳中没食子酸和原儿茶酸的含量［J］.西北药学杂志，2010，25（3）：190－192.

［3］汗克孜·吐尔逊，迪力努尔·艾合买提.HPLC法测定血宁安吉杷尔糖浆中没食子酸的含量［J］.西北药学杂志，2013，28（1）：38－39.

［4］希尔艾力·吐尔逊，曼尔丹·尼牙孜，库尔班尼沙·买提卡思木，等.阿米乐努西达日蜜膏中没食子酸的含量测定［J］.医药导报，2012，31（3）：350－352.

［5］张华，裴桂珍，李桂华，等.鞣花酸片剂的制备及其含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（13）：39－42.

［6］张雯丽，孙冬晓，董丽华.RP－HPLC法同时测定金钱草和广金钱草中绿原酸、槲皮素和山柰酚的含量［J］.西北药学杂志，2013，28（5）：486－488.

Simultaneous determination of gallic acid and ellagic acid in Kaixinizi Pulvis by RPHPLC

LI Jianmei，Zulpiya TALAT，Kurbannisa MATKASIMU，Xirali TURSUN＊（Key Laboratory of Traditional Uyghur Medicine Prescription of Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China）

Objective To simultaneously determine gallic acid and ellagic acid in Kaixinizi Pulvis.Methods An RP－HPLC method was developed.The separation was performed on a C18（250mm×4.6mm，5μm）column with a gradient elution system of methanol－acetonitrile－2mL·L－1phosphoric acid at a flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 254nm.Results The linear ranges of determination for gallic acid and ellagic acid were 0.132－0.792μg（r＝0.999 9），and 0.108－0.648 2 μg（r＝0.999 9），respectively.The average recoveries were 99.3%and 98.8%，respectively.The relative standard deviation of precision of the method were 1.4%and 1.7%（n＝6），respectively.Conclusion This method is simple，rapid，accurate and reliable for the quality control of Kaixinizi Pulvis.

gallic acid；ellagic acid；RP－HPLC；Kaixinizi Pulvis

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.008

R284.1

A

1004－2407（2015）01－0026－03

2014－07－21）

新疆维吾尔自治区公益性科研院所项目（编号：XJYS1104－2011－01）

李建梅，女，助理研究员，硕士

＊通信作者：希尔艾力·吐尔逊，男，主任药师